兩種碘化丙啶染色DNA定量方法檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡結(jié)果的比較

徐曉雪 戶(hù)乃麗 孫麗娜 孔 璐

(1.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069)

碘化丙啶(propidium iodide，PI)是插入性核酸染料，直接插入雙鏈核酸的2個(gè)堿基對(duì)之間，每5個(gè)堿基插入1個(gè)熒光分子，與核酸的結(jié)合均勻、穩(wěn)定。細(xì)胞經(jīng)過(guò)RNA酶處理后，PI可以與細(xì)胞內(nèi)DNA特異性結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上經(jīng)488 nm激光激發(fā)，發(fā)出峰值610～620 nm的熒光，可以準(zhǔn)確的反映細(xì)胞群體中DNA含量的分布情況，適用于DNA定量檢測(cè)。根據(jù)細(xì)胞周期中不同時(shí)項(xiàng)DNA的變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞周期中DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)各時(shí)項(xiàng)的細(xì)胞比例。因?yàn)镻I是適用于所有流式細(xì)胞儀的染料，這一染色技術(shù)在臨床腫瘤診斷和醫(yī)學(xué)科研中被普遍的采用，常規(guī)使用的染色方法是包括固定、RNA酶處理、PI飽和染色3個(gè)關(guān)鍵步驟的3步法PI染色技術(shù)［1］。在一些研究中，當(dāng)細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下發(fā)生了凋亡，DNA損傷，細(xì)胞內(nèi)DNA降低，也可以采用3步法PI染色檢測(cè)亞G1峰(也稱(chēng)作凋亡峰)，用于凋亡細(xì)胞比例和特征的分析［2］。但是在實(shí)際應(yīng)用中，由于凋亡時(shí)相的不同，當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞中DNA損傷部分沒(méi)有完全脫出細(xì)胞時(shí)，往往檢測(cè)不到明確可辨的亞G1峰，敏感度較低。作為細(xì)胞凋亡檢測(cè)的經(jīng)典方法之一的彗星檢測(cè)［3］，以細(xì)胞在電泳移動(dòng)中DNA的遷移形態(tài)作為凋亡的特征指標(biāo)，此技術(shù)中比較關(guān)鍵的一步即采用堿性高滲試劑使凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA碎片脫出細(xì)胞，從而在電泳遷移中呈現(xiàn)出彗星尾樣的拖痕，本課題組利用類(lèi)似方法，用高滲緩沖液作用于固定后的懸浮細(xì)胞，使凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂DNA較徹底的脫出細(xì)胞外，再進(jìn)行DNA定量檢測(cè)，提高對(duì)細(xì)胞凋亡的識(shí)別度和敏感性［4］。

本實(shí)驗(yàn)以DNA合成抑制劑喜樹(shù)堿作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并用Annexin V標(biāo)記流式檢測(cè)確認(rèn)細(xì)胞凋亡存在，比較了常規(guī)PI單色DNA定量檢測(cè)法與滲透法PI單色DNA定量檢測(cè)法檢測(cè)正常和凋亡細(xì)胞樣品的結(jié)果，同時(shí)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。

1 材料和方法

1.1 材料

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系提供;1 mmol/L喜樹(shù)堿溶液(Sigma公司，美國(guó));異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)Annexin V染色試劑(BD公司，美國(guó));10×Annexin V結(jié)合緩沖液(BD公司，美國(guó));70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液(蒸餾水配制，4℃預(yù)冷);磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液(DNA抽提緩沖液，pH 7.8，192 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，8 mL 0.1 mol/L 檸檬酸，4℃保存);0.002%RNAse溶液(2 mg RNAse，0.1 mL Triton X-100，100 mL PBS，pH 7.2 ～7.4，新鮮配制);0.05%PI染液(5 mg PI，0.1 mL Triton X-100，10 mL PBS，pH 7.2～7.4，于4℃避光保存);EPICS@XL流式細(xì)胞儀(貝克曼公司，美國(guó));TIS倒置熒光顯微鏡(尼康公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于3個(gè)6孔板，每孔接種1.5 mL，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37℃，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，其中9孔細(xì)胞作為正常培養(yǎng)對(duì)照，另外9孔細(xì)胞中各加入5 μL，1 mmol/L喜樹(shù)堿溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。分別收集各孔細(xì)胞，得到18個(gè)同步培養(yǎng)細(xì)胞樣品，取正常培養(yǎng)和刺激凋亡細(xì)胞各1例，進(jìn)行FITC Annexin V標(biāo)記凋亡檢測(cè)，驗(yàn)證凋亡的存在，再將剩余16例樣品各自充分混勻后平均分入兩管，得兩兩一對(duì)的共32例樣品，分為4組，分別是正常培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)染色組，正常培養(yǎng)細(xì)胞滲透染色組，刺激凋亡細(xì)胞常規(guī)染色組，刺激凋亡細(xì)胞滲透染色組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1)凋亡檢測(cè):對(duì)正常細(xì)胞和刺激凋亡細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行FITC Annexin V標(biāo)記凋亡檢測(cè)。樣品離心，棄去上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，各取單細(xì)胞懸液含有3×105個(gè)細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液，充分混合，避光，室溫下孵育10 min，同時(shí)取相同量細(xì)胞加入5 μL PBS充分混合，避光，室溫下孵育10 min，作為未染色對(duì)照。再向樣本和對(duì)照管中分別加入10倍稀釋的結(jié)合緩沖液500 μL，避光，室溫下孵育5 min，全程采用無(wú)菌操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2)PI染色DNA含量分析:樣品固定:將單細(xì)胞懸液充分吹打加入盛有5 mL 4℃ 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的離心管中，充分混勻，置于4℃冰箱中固定4 h以上。洗滌:固定細(xì)胞離心棄去固定劑。對(duì)滲透處理染色組細(xì)胞增加磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液浸洗步驟:加入1 mL磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液，室溫孵育10 min，300 g(相對(duì)離心力單位，g=9.8 m/s2)離心5 min，棄上清，加入PBS充分混勻。RNA酶處理:將洗滌后棄去上清的各組細(xì)胞懸液各加入1 mL RNA酶溶液，37℃反應(yīng)30 min，置于室溫冷卻。PI染色:向試管中加入0.1 mL PI染液，染色30 s，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle軟件進(jìn)行周期分析。

3)顯微鏡觀察:每例PI染色標(biāo)本在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采集相差和熒光疊加圖像，同時(shí)顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)和熒光標(biāo)記情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組DNA含量分析所得數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，將兩種不同染色方法檢測(cè)相同樣品得到的結(jié)果的百分?jǐn)?shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

以流式細(xì)胞儀FITC通道檢測(cè)Annexin V標(biāo)記情況，在FITC橫坐標(biāo)熒光直方圖中，選取熒光高于對(duì)照樣品的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞群，P2門(mén)代表凋亡細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞P2=0.1%，正常細(xì)胞樣品P2=2.6%，刺激凋亡細(xì)胞樣品P2=31.7%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 活細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.1 FITC Annexin V apoptosis analyse

2.2 流式DNA含量分析結(jié)果

如圖2所示，A、B為正常HL-60細(xì)胞的兩種方法DNA定量結(jié)果，C、D為刺激凋亡細(xì)胞的兩種方法DNA定量結(jié)果，各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果詳見(jiàn)表1，對(duì)于正常細(xì)胞兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于刺激凋亡細(xì)胞兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

鏡下可見(jiàn)(圖3)細(xì)胞經(jīng)過(guò)RNA酶處理后細(xì)胞核形態(tài)清晰，PI染色明確。常規(guī)染色法:正常細(xì)胞組細(xì)胞呈聚集分布，胞膜光滑、完整，胞核圓形，染色均勻，可見(jiàn)分裂項(xiàng)，胞質(zhì)可見(jiàn);滲透染色法:正常細(xì)胞組呈單個(gè)分布，胞膜光滑、完整，胞核圓形，染色均勻，可見(jiàn)分裂項(xiàng);常規(guī)染色法:刺激凋亡組細(xì)胞呈聚集分布，胞膜褶皺增多，稍不完整，染色較均勻，分裂項(xiàng)形態(tài)不清晰;滲透染色法:刺激凋亡細(xì)胞組呈單個(gè)分布，部分細(xì)胞發(fā)生胞膜皺縮、包膜破裂，胞核皺縮或松散，核染色變淡或染色區(qū)縮小，可見(jiàn)空細(xì)胞。

3 討論

圖2 DNA含量直方圖Fig.2 DNA content histograms of corresponding

表1 各組DNA含量分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 The statistical analysis of the data of DNA content analysis (%)

圖3 PI染色HL-60細(xì)胞相差與熒光疊加圖像Fig.3 Phase contrast and fluorescence overlay photographys of HL-60 cells stained with PI

作為DNA定量檢測(cè)的經(jīng)典方法的PI染色法被認(rèn)為可以作為觀察細(xì)胞凋亡的重要手段之一，但是由于致凋亡因素、凋亡程度及細(xì)胞自身?xiàng)l件的差異，僅采用PI 3步法DNA定量檢測(cè)難以清晰的呈現(xiàn)凋亡特有的亞G1峰，更多的時(shí)候可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞周期出現(xiàn)不規(guī)則變化，主要的原因可能在于經(jīng)過(guò)固定凋亡細(xì)胞DNA損傷后的DNA碎片不能自由的脫出細(xì)胞外，造成DNA下降不明顯，對(duì)于發(fā)生在S期和G2/M期的凋亡尤其如此，即使是發(fā)生在G0G1期的凋亡，也有可能僅表現(xiàn)為G0G1峰的變異度增加，而無(wú)法檢測(cè)到凋亡峰的存在。

為了增加PI染色法對(duì)凋亡的敏感程度，人們做過(guò)很多嘗試［4］，其中包括采用延時(shí)檢測(cè)，等待DNA自然脫出細(xì)胞后識(shí)別亞G1峰的方法，但隨意性大、可靠度低，并且無(wú)法控制，且受樣品凋亡的不同階段限制，效果不一。本試驗(yàn)中的檸檬酸緩沖液即利用類(lèi)似滲透原理，作用于固定后的懸浮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)滲透壓的變化，結(jié)合洗滌，使凋亡細(xì)胞內(nèi)已斷裂的DNA松解后較徹底的脫出細(xì)胞外，再進(jìn)行DNA定量檢測(cè)，由于其對(duì)正常細(xì)胞DNA含量沒(méi)有影響，所以可以明顯提高對(duì)細(xì)胞凋亡的識(shí)別度和敏感性。從形態(tài)學(xué)觀察中也看到滲透染色后刺激凋亡組細(xì)胞出現(xiàn)了較為多樣的改變，這可能和細(xì)胞所處周期時(shí)項(xiàng)不同及凋亡后變化多樣有關(guān)，但總體上可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞膜在處理中都被保存，但細(xì)胞的核染色質(zhì)降低，另外與正常染色組比較胞質(zhì)明顯減少。

本實(shí)驗(yàn)中用Annexin V標(biāo)記活細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果高于經(jīng)磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液滲透后的PI染色檢測(cè)到的凋亡百分比，這可能是由于染色原理不同造成的凋亡檢測(cè)時(shí)項(xiàng)不同，Annexin V特異性與細(xì)胞表面磷酯酰絲氨酸結(jié)合，在細(xì)胞凋亡早期即可出現(xiàn)特征性的膜磷酯酰絲氨酸外翻，較DNA反應(yīng)更早出現(xiàn)。但是Annexin V標(biāo)記法更適合于活細(xì)胞樣品檢測(cè)，無(wú)法對(duì)儲(chǔ)存樣品進(jìn)行檢測(cè)，并且試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，操作要求無(wú)菌，受結(jié)合緩沖液中成分影響較大，結(jié)果不可重復(fù)［5］。

本文介紹的磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液滲透后PI染色DNA定量法具有流式實(shí)驗(yàn)快速、準(zhǔn)確、定量的特點(diǎn)，并且具有經(jīng)典PI染色DNA定量分析方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、適用范圍廣，可檢測(cè)儲(chǔ)存樣品的優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于科研，也可以用于快速檢測(cè)臨床患者的血液、骨髓等樣本，對(duì)于化學(xué)治療患者細(xì)胞損傷情況的檢測(cè)有一定意義［4，6-7］。由于采用了滲透抽提斷裂DNA的步驟，檢測(cè)的準(zhǔn)確度明顯提高，與傳統(tǒng)方法比較提高了對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別敏感度，又保留了傳統(tǒng)DNA定量檢測(cè)的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。這一DNA抽提的方法與DNA凝膠電泳以及彗星檢測(cè)的技術(shù)原理類(lèi)似，檢測(cè)的敏感度相當(dāng)，所適用的凋亡或DNA損傷程度也相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)中需要注意的是有些細(xì)胞由于DNA脫出可能形成空細(xì)胞，在流式圖中表現(xiàn)為細(xì)胞群體中DNA含量極低的有形顆粒，這些也應(yīng)計(jì)入凋亡細(xì)胞。

此檢測(cè)方法也有不足，在有些損傷條件下如果原G2M期細(xì)胞DNA含量稍許降低后并不一定會(huì)出現(xiàn)在低于G1峰的位置，也可能藏于G1-G2M期內(nèi)，造成凋亡比例的低估，在具體操作中較好的解決方法是對(duì)比兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果，未經(jīng)抽提的細(xì)胞更多的提示損傷或凋亡細(xì)胞所處的周期時(shí)相，滲透抽提后發(fā)生變化的部分提示凋亡細(xì)胞的比例，兩者對(duì)應(yīng)可以大體判斷凋亡的細(xì)胞周期時(shí)相和比例。

對(duì)于喜樹(shù)堿致凋亡HL-60細(xì)胞模型，經(jīng)過(guò)高滲溶液DNA碎片抽提的PI單色DNA定量檢測(cè)法能夠更為清晰準(zhǔn)確的呈現(xiàn)出細(xì)胞周期中的凋亡峰，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞DNA定量檢測(cè)沒(méi)有明顯影響，將兩種細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比可以初步推斷本試驗(yàn)中細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期的S期時(shí)相。

［1］ Darzynkiewicz Z.Critical aspects in analysis of cellular DNA content［J］.Curr Protoc Cytom，2011，Chapter 7:Unit 7.2.

［2］ Wlodkowic D，Telford W，Skommer J，et al.Apoptosis and beyond:cytometry in studies of programmed cell death［J］.Methods Cell Biol，2011，103:55-98.

［3］ 晉藝聰，洪帥，焦玉國(guó).單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷的方法及應(yīng)用［J］.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，19(4):17-21.

［4］ Wlodkowic D，Skommer J，Darzynkiewicz Z.Cytometry of apoptosis.Historical perspective and new advances［J］.Exp Oncol，2012，34(3):255-262.

［5］ Trahtemberg U，Atallah M，Krispin A，et al.Calcium，leukocyte cell death and the use of annexin V:fatal encounters［J］.Apoptosis，2007，12(10):1769-1780.

［6］ Zhang H Y，Hormi-Carver K，Zhang X，et al.In benign Barrett's epithelial cells，acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks［J］.Cancer Res，2009，69(23):9083-9089.

［7］ 高楓，符兆英.天然產(chǎn)物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18(7):557-560.