siRNA干擾TRIM29基因?qū)θ朔伟㎞CI-H520細(xì)胞株增生及遷移能力的影響

劉春曉 李 輝 侯生才 胡 濱 苗勁柏 張文謙

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院胸外科，北京100020)

肺癌已成為當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一。肺癌的臨床治療包括外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療及分子靶向治療等多學(xué)科綜合治療。對(duì)肺癌發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的研究能為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。TRIM29定位于llq23，是TRIM家族的一員，含鋅指基因序列，可能是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。有研究者［1］發(fā)現(xiàn)TRIM29在非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)組織中表達(dá)有差異，但對(duì)其具體作用的研究仍較少。本研究發(fā)現(xiàn)，采用RNA干擾技術(shù)，抑制TRIM29的表達(dá)，可抑制肺癌細(xì)胞株NCI-H520的增生和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人肺癌細(xì)胞株(NCI-H520)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)液及血清均為美國Hyclone公司產(chǎn)品?？俁NA提取Trizol試劑盒，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司。TRIM29引物和內(nèi)參β-actin引物以及siRNA片段由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。TRIM29抗體購自Cell Signaling Technology公司。MTT試劑和Transwell小室均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人肺癌NCI-H520細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液中，并置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，先將細(xì)胞種于6孔板，使其在24 h內(nèi)到達(dá)70% ～80%融合。加藥前30～40 min換液，加1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基。配置siRNA 5 μL+250 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，lipo 2000 5 μL+250 μL培養(yǎng)基基礎(chǔ)室溫下靜置5 min，將上述溶液混勻，靜置20 min后將混合液逐滴均勻加入孔板，8 h后觀察，必要時(shí)換成全培養(yǎng)基，48～72 h后檢測(cè)。轉(zhuǎn)染siRNA(sense:5'-GAGCUGCGCAAGUCCAUUUTT-3')。轉(zhuǎn)染siRNANC(sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')組作為陰性對(duì)照組，未做任何處理組細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.3 Real-time PCR 檢測(cè)

Trizol法提取各實(shí)驗(yàn)組NCI-H520細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量?？俁NA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR引物TRIM29基因正義鏈為:5'-GACATCATACCAGCCCTCGT-3';反義鏈為:5'-ATCCCGTTGCCTTTGTTGAC-3'。β-actin基因引物正義鏈為:5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3';反義鏈為:5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.4 Western blotting 分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，利用RIPA細(xì)胞裂解液(購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取總蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid，BCA)試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整待測(cè)樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加50 μg的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶200稀釋一抗，置4℃冰箱過夜。PBST沖洗膜3次，每次10 min，分別按1∶10 000稀釋二抗溫育l h，PBST沖洗膜3次，每次10 min。通過Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(購自美國Licor公司)讀取目的電泳條帶的密度值。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生

將各組處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板.每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔和空白對(duì)照。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h后，棄上清，再加入二甲基亞砜每孔150 μL，于微量振蕩器充分振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀按參比波長為470 nm測(cè)定各孔吸光度A值。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

采用美國Sigma公司的Transwell小室，消化6孔板中已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好的NCI-H520細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，溫育24 h后分別加入含有空白對(duì)照或NC control或siRNA的培養(yǎng)基48 h后消化離心，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/mL，取0.2 mL接種到Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))滅活血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細(xì)胞，予90%(體積分?jǐn)?shù))甲醇固定，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色，洗凈風(fēng)干后于熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。采用Graphpad Prism 5.0繪圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR及Western blotting法檢測(cè)siRNA干擾后TRIM29基因及蛋白的表達(dá)

RT-PCR和Western blotting法分析分別檢測(cè)siRNA干擾TRIM29基因后在基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組、NC組相比，siRNA處理組NCI-H520細(xì)胞的TRIM29的mRNA、蛋白水平的表達(dá)量均被顯著抑制(圖1)。

2.2 siRNA降低TRIM29基因表達(dá)抑制NCI-H520細(xì)胞增生

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生，結(jié)果如圖2所示，與空白組及對(duì)照組比較，TRIM29 siRNA轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞生長明顯減慢。

2.3 siRNA降低TRIM29基因表達(dá)抑制NCI-H520細(xì)胞的遷移能力

Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖3所示:與空白組及對(duì)照組比較，TRIM29 siRNA轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞遷移能力明顯減弱。

3 討論

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，雖然外科手術(shù)切除聯(lián)合化療等綜合治療已取得了明顯進(jìn)步，但肺癌患者的生存率仍然不高。為了提高肺癌患者的遠(yuǎn)期生存率，充分認(rèn)識(shí)肺癌的生物學(xué)行為的分子機(jī)制具有重要作用。

圖1 轉(zhuǎn)染TRIM29 siRNA后NCI-H520細(xì)胞中TRIM29 mRNA及蛋白的表達(dá)量Fig.1 Specific downregulation of TRIM29 mRNA and protein expression by TRIM29 siRNA

圖2 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后NCI-H520細(xì)胞的增生活性Fig.2 MTT assay used to evaluate NCI-H520 cell proliferation

TRIM29蛋白屬于三結(jié)構(gòu)域(tripartite motif，TRIM)蛋白家族，含有一系列保守的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域:RING指結(jié)構(gòu)域(R)，1型B-box和/或2型B-box結(jié)構(gòu)域(B1-B2)，coiled-coil結(jié)構(gòu)域(CC)［2］。TRIM29 是近年來逐漸受到關(guān)注的具有多種生物學(xué)功能的蛋白，其表達(dá)有明顯的組織和細(xì)胞特異性，多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)明顯增高［2-4］。最近一項(xiàng)研究［5］表明，與周圍正常肺組織相比，TRIM29蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)增高［1］。本研究利用 RNAi技術(shù)，將特異性針對(duì)TRIM29基因的siRNA片段轉(zhuǎn)染進(jìn)入肺癌NCI-H520細(xì)胞中，結(jié)果，與空白對(duì)照組及NC組相比，siRNA處理組TRIM29 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。此結(jié)果提示，在NCI-H520細(xì)胞中，TRIM29siRNA能夠有效、特異性地抑制TRIM29的表達(dá)。

圖3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后NCI-H520細(xì)胞的遷移能力Fig.3 Transwell assay used to determine the invasion capacity of NCI-H520 cells

近年來對(duì)TRIM29的研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤細(xì)胞中，TRIM29的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增生及生長有關(guān)。Wang等［9］發(fā)現(xiàn)TRIM29蛋白可以通過激活Wnt/betacatenin通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增生。Jiang等［10］報(bào)道TRIM29蛋白在直腸癌細(xì)胞增生過程中起重要作用，干擾TRIM29蛋白的表達(dá)，可抑制直腸癌細(xì)胞的增生。Yuan等［11］證實(shí)TRIM29蛋白可以通過抑制p53的活性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生。本研究使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增生，與空白組及對(duì)照組比較，TRIM29 siRNA轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞生長明顯減慢。此結(jié)果提示，TRIM29可能參與誘導(dǎo)NCI-H520細(xì)胞的生長。

最近的一項(xiàng)研究［1］發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中，TRIM29的表達(dá)與肺癌的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)密切相關(guān)。進(jìn)一步研究抑制TRIM29的表達(dá)對(duì)NCI-H520細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示與空白組及對(duì)照組比較，TRIM29 siRNA轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞遷移能力明顯減弱。此研究結(jié)果提示，TRIM29可能與NCI-H520細(xì)胞的遷移及侵襲能力有關(guān)。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)TRIM29可能參與多種腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲，Jiang等［10］報(bào)道TRIM29的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kosaka等［3］發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，增加TRIM29的表達(dá)，可提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，RNAi技術(shù)可以有效抑制TRIM29的表達(dá)，進(jìn)而抑制NCI-H520細(xì)胞的增生和遷移能力。TRIM29可能成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。

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