內(nèi)源ABA的生物途徑及對非生物脅迫的響應(yīng)機制

韓 璐，王曉萍

(哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室)

0 引言

脫落酸(ABA)于20世紀60年代被首次發(fā)現(xiàn)，是一種傳統(tǒng)的植物激素，在植物生長和發(fā)育的一系列生理進程中起到至關(guān)重要的作用，諸如促進種子的成熟，種子的休眠，影響種子萌發(fā)以及適應(yīng)非生物脅迫等等［1］，即ABA不僅是細胞信號而且還是系統(tǒng)逆境信號，主要調(diào)控這些進程的是內(nèi)源具有活性的ABA，而植物內(nèi)源ABA含量的水平是由ABA的合成速率和代謝速率共同決定的［2］，因此，為了解ABA水平是如何被調(diào)控的，研究參與ABA合成和代謝的相關(guān)基因就變的非常重要．

1 內(nèi)源ABA的生物途徑

1．1 高等植物ABA的合成途徑

已有的研究證實，高等植物脫落酸是由C40類胡蘿卜素前體經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化所得(如圖1所示)．目前，高等植物的ABA生物合成通路的生化和分子遺傳研究已經(jīng)很透徹．在水稻C40途徑早期階段，八氫番茄紅素脫氫酶(OsPDS)、類胡蘿卜素異構(gòu)酶(OsCRTISO)和番茄紅素β-羥化酶(β-OsLCY)和ζ-胡蘿卜素去飽和酶(Os-ZDS)、等酶類參與類胡蘿卜素合成，編碼這些酶的基因若發(fā)生了突變，突變體中ABA含量較野生型降低，表型體現(xiàn)均為穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting，PHS)，PHS是一種ABA缺陷表型，這說明這些酶類是ABA的類胡蘿卜素前體合成的重要酶［4］．中期階段產(chǎn)物番茄素轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)，這一步驟需要經(jīng)過環(huán)化及羥基化，質(zhì)體中的玉米黃質(zhì)在玉米黃素環(huán)氧化酶(ZEP)的催化下變成環(huán)氧玉米黃素，再進而催化成堇菜黃素，這一步驟在堇菜黃素脫環(huán)氧酶-VDE的作用下可逆．水稻中編碼玉米黃素環(huán)氧化酶的基因是Os-ABA1，Osaba1突變株是一個由Tos17插入產(chǎn)生的OsABA1缺失突變體，表型為萎蔫，檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源ABA含量很低，干旱脅迫下脫落酸的含量也不會升高．這個突變體被證明是玉米黃素的環(huán)氧化過程受阻，即不能合成脫落酸［5］．堇菜黃質(zhì)在酶的催化下轉(zhuǎn)化成一類9'-順式環(huán)氧類胡蘿卜素如9'-順式紫黃質(zhì)和9'-順式新黃質(zhì)，這些產(chǎn)物被9'-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)進一步催化成黃質(zhì)醛［6］，在短鏈乙醇脫氫酶(SDR)催化下和乙醛氧化酶的氧化作用最終形成ABA．針對擬南芥的分子遺傳分析證實，在種子萌發(fā)和發(fā)育階段的ABA合成過程中，擬南芥9'-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(At-NCED)起到重要作用，9'-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶家族在擬南芥中有5個家族成員，每個成員在調(diào)控過程中的功能都不完全相同［7］，AtNCED6和 AtNCED9在種子的發(fā)育和萌發(fā)階段ABA的合成起主要作用［8］，而AtNCED3是參與高滲條件下種子萌發(fā)過程［9］．

圖1 ABA生物合成途徑［5］

1．2 高等植物ABA的代謝途徑

與ABA合成途徑的研究相比，人們對ABA代謝途徑相關(guān)酶和他們的調(diào)控方式的研究仍不全面［1］．目前研究認為ABA的代謝在高等植物中主要有兩種方式:一種是糖結(jié)合失活途徑;另一種是ABA甲基羥基化代謝途徑．

糖結(jié)合導(dǎo)致ABA失活的產(chǎn)物是脫落酸葡萄糖酯(ABA—Glucosylester，ABA-GE)，多以穩(wěn)定的形式存在于植物的酸性液泡，ABA-GE可在β-葡萄糖苷酶的作用下迅速水解，產(chǎn)物為具有活性、游離的 ABA，以應(yīng)答環(huán)境脅迫［10］．糖類代謝的另一作用是參與ABA的合成，已有研究表明可溶性糖類也參與調(diào)控植物的發(fā)育，生理和代謝過程［11］，遺傳研究顯示葡萄糖和其他糖類作為初級的信號分子影響著種子的萌發(fā)和早期種子發(fā)育［12-13］，糖類伴隨著植物激素合成和信號傳導(dǎo)共同參與種子萌發(fā)的過程，特別是與ABA的聯(lián)合作用更為顯著［14］．基因芯片實驗結(jié)果證實了許多基因的表達受到糖和ABA的共調(diào)控作用，包括參與糖類代謝，代謝運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一些基因［15-16］．?dāng)M南芥中與ABA合成相關(guān)的基因如ABA2和NCED3也能被葡萄糖所誘導(dǎo)并參與葡萄糖信號反應(yīng)［17］．ABA缺陷突變體 aba2/gin1和aba3/gin5，ABA不敏感突變體abi4/gin6、abi5和abi8，這些突變體都表現(xiàn)為糖不敏感表型［18］，這說明ABA的合成同時也調(diào)控葡萄糖信號通路．

高等植物的ABA甲基羥基化途徑有三種:9'甲基羥基化、8'甲基羥基化、7'甲基羥基化．產(chǎn)物分別是 9'-OH-ABA、8'-OH-ABA、7'-OH-ABA，這些產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)都極不穩(wěn)定，9'-OH-ABA進一步環(huán)化成新紅花菜豆酸(neo-PA)，8'-OH-ABA發(fā)生親核反應(yīng)生成紅花菜豆酸(PA)，PA進一步還原成二氫紅花菜豆酸(DPA)或差位異構(gòu)體 epi-DPA［19-20］，其中 7'甲基羥基化途徑并不是十分重要，這三種羥化酶都屬于細胞色素P450(CYP)家族．高等植物ABA代謝最主要的途徑是8'甲基羥基化(如圖2所示)，產(chǎn)物PA的活性并未完全喪失，但較未8'甲基羥基化的ABA活性要弱很多，而DPA是完全無活性的，若ABA大量降解，植物體內(nèi)PA和DPA的含量急劇升高．故內(nèi)源ABA的水平可以通過內(nèi)源PA和DPA含量的檢測來判斷．

植物中不同物種編碼8'-羥化酶的基因家族成員的數(shù)量也不同，如擬南芥中編碼此酶的CYP707A成員目前發(fā)現(xiàn)四個，玉米中ABA8ox成員有五個，大豆和高粱有三個，小麥鐘僅有兩個，水稻中有三個可能編碼OsABA8ox的基因，命名為OsABA8ox1、2、3．圖3所示三種代表性禾本科植物玉米、水稻和高粱的ABA8ox家族基因組結(jié)構(gòu)比對，將同源基因分為一個分支，共三個:ox1、ox2、ox3，結(jié)果具有明顯的邏輯規(guī)律，除ox3中高粱的外顯子數(shù)較少與另外幾個同源基因的外顯子數(shù)目不符外，另兩個分支都有一定的規(guī)律性可言:ox2的外顯子數(shù)都是9;ox1的外顯子數(shù)是5與ox2相比較少．圖4是幾種典型的雙子葉和單子葉植物ABA8ox家族編碼的蛋白序列的系統(tǒng)進化分析．

圖2 高等植物ABA的8'羥基化代謝途徑［21］

圖3 ABA8ox基因家族旁系同源和直系同源基因結(jié)構(gòu)(方塊-外顯子，直線-內(nèi)含子)［21］

之前提到可溶性糖類參與種子的萌發(fā)和早期種子發(fā)育過程，影響ABA的合成，進而影響植物體內(nèi)ABA含量．植物內(nèi)源ABA含量不光由合成決定，也取決于代謝的速率．用不同濃度的葡萄糖處理萌發(fā)期的水稻種子，熒光定量檢測Os-NCED和OsABA8ox家族的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的葡萄糖處理對增強OsNCED2表達水平的作用不是很強，僅在高濃度6%葡萄糖處理時顯著升高，升高情況與甘露醇處理組一致，推測升高是由于滲透脅迫導(dǎo)致，其他OsNCED的mRNA水平變化不明顯;而低濃度外源葡萄糖能明顯抑制OsABA8ox基因，尤其是OsABA8ox2和OsABA8ox的表達［22］，說明葡萄糖誘導(dǎo)的種子萌發(fā)延遲是由于ABA的分解抑制而非ABA的合成增強所介導(dǎo)．去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)是NCED酶的有效抑制劑，可阻礙ABA合成［23］;烯唑醇(diniconazole)是ABA8'羥化酶的競爭性抑制物，也是 ABA代謝的有效抑制劑［24］．當(dāng) ABA的合成被NDGA所抑制，水稻種子萌發(fā)無影響，烯唑醇處理抑制ABA的分解后水稻種子萌發(fā)受到抑制，表明ABA的分解代謝在種子萌發(fā)調(diào)節(jié)中起主要作用．ABA的合成和代謝有時候會共同作用于植物生理發(fā)育和響應(yīng)脅迫的過程．如水稻在淹水脅迫下，為了伸長莖稈內(nèi)源ABA的水平會下降，在淹水1 h后OsABA8ox1的mRNA水平升高，而OsZEP和OsNCEDs等合成基因的表達在淹水1～2 h后下降，乙烯及其前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)可誘導(dǎo)水稻OsABA8ox1的表達，而乙烯活性抑制劑可抑制淹水對OsABA8ox1的誘導(dǎo)，OsABA8ox1的表達水平與ABA含量負相關(guān)，這說明水稻處于淹水條件下ABA含量降低一部分是由乙烯誘導(dǎo)的OsABA8ox1的所調(diào)控，一部分是受不依賴于乙烯的ABA合成基因的表達抑制調(diào)控．OsABA8ox1-GFP融合表達后，定位在洋蔥表皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，證明ABA8ox1 為膜蛋白［22］．

圖4 代表性雙子葉和單子葉植物編碼ABA8'羥化酶基因的蛋白系統(tǒng)進化樹［21］

2 ABA對非生物脅迫的響應(yīng)機制

高等植物處于逆境脅迫的條件下，內(nèi)源ABA的含量會增加，產(chǎn)生諸如溶質(zhì)外流間接導(dǎo)致保衛(wèi)細胞氣孔關(guān)閉等一系列響應(yīng)脅迫變化，研究表明，ABA對旱脅迫和鹽逆境的響應(yīng)最為顯著．脅迫下的植物的變化在細胞水平的體現(xiàn)是:膨壓的下降，溶質(zhì)含量的變化，膜結(jié)構(gòu)的變化［25］．例如，在響應(yīng)干旱時，細胞為了避免失水會增強耐受脫水性，使胞內(nèi)的膨壓維持平衡狀態(tài)［26］;為了抵抗脅迫，形態(tài)學(xué)性狀和發(fā)育也會發(fā)生改變，如莖根的伸長或生長抑制、葉片的厚度和卷曲度都能使植物適應(yīng)環(huán)境的改變［27］;生理生化反應(yīng)的改變主要體現(xiàn)在有機酸的累積，光合作用緩慢如氣孔的關(guān)閉和糖代謝途徑的改變．干旱脅迫發(fā)生后，體內(nèi)會產(chǎn)生滲透保護劑，溶解和滲透物也會發(fā)生聚集，逆境消除后這些物質(zhì)會隨之降解［28］．高等植物在應(yīng)答非生物逆境時在基因調(diào)控的分子水平上也會發(fā)生變化，近幾十年利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因表達分析等手段，尋找到很多與非生物脅迫相關(guān)的基因，這些基因或者蛋白受到干旱、高鹽或者低溫的誘導(dǎo)．基因芯片數(shù)據(jù)表明某些基因會同時受干旱和高鹽的誘導(dǎo)，推測這幾種非生物脅迫之間存在信號交叉途徑［29］．響應(yīng)非生物脅迫的基因同時也受到脅迫激素的調(diào)控，如ABA含量會影響這些基因的表達水平．對ABA不敏感突變株或ABA缺陷突變體的研究發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫能誘導(dǎo)一部分基因的表達，而另一些本應(yīng)被脅迫誘導(dǎo)表達的基因卻無變化，我們就此推測脅迫應(yīng)答基因的表達有兩種調(diào)控體系:ABA依賴型和ABA非依賴型(如圖5所示)，為闡述調(diào)控機制，基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其相應(yīng)順式作用原件的研究是必不可少的．

圖5 擬南芥應(yīng)答低溫和脫水逆境的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［30］

2．1 依賴ABA的脅迫應(yīng)答

基因可以受到ABA的調(diào)控是因為在基因的啟動子存在相對保守的順式作用元件—ABRE(ABA-responsive element，PyACGTGGC)，這個元件是在小麥調(diào)控晚期胚胎發(fā)育的EM基因［31］和水稻脫水組織及成熟種子有表達的RAB16［32］中首次發(fā)現(xiàn)的，ABA對基因的調(diào)控就最主要是通過ABRE．啟動子上的G-box元件也可以受ABA的調(diào)控，并且通過啟動子缺失克隆分析，G-box可以調(diào)和不同的啟動子區(qū)域受到各自相應(yīng)的刺激．啟動子轉(zhuǎn)錄激活過程的發(fā)生除G-box外至少還需要一個順式作用元件．對于ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄來說一個拷貝的ABRE元件是遠遠不夠的，ABRE必須和偶聯(lián)元件-CE組成ABA-敏感復(fù)合體，研究證實小麥中，HVA1和HVA22基因就是由 ABRE和 CE1、CE2復(fù)合體調(diào)控的［33］．有些蛋白可以結(jié)合 ABRE(ABRE-binding factors)也稱作AREB/ABF，這個蛋白的轉(zhuǎn)錄激活劑功能是通過原生質(zhì)體的瞬時表達研究發(fā)現(xiàn)的［34］，大部分AREB亞蛋白都參與營養(yǎng)組織和根部的 ABA誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［35］．有些ABA依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，基因的啟動子區(qū)域可以不含ABRE，需要一個或者多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合激活下游基因的調(diào)控．?dāng)M南芥的RD22基因被MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子共同識別，激活基因的表達，MYB和MYC大量上調(diào)表達的植株是ABA敏感型，導(dǎo)致滲透脅迫的耐受性增強［36］．

2．2 ABA非依賴型傳導(dǎo)途徑

某些逆境響應(yīng)基因?qū)BA并不敏感，表達水平也不完全受ABA的調(diào)控．對這些基因的啟動子區(qū)域利用缺失克隆和堿基突變的技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，存在著一段保守區(qū)域，這段9bp的堿基序列可應(yīng)答逆境脅迫，命名為DRE(dehydration responsive element)．在ABA依賴型的信號途徑中ABRE行使功能時必須要存在多個拷貝，而DRE與之不同，單拷貝并且不需要偶聯(lián)原件的協(xié)助作用就能調(diào)控下游基因的表達．還有類似DRE的作用元件，他們序列的相似性很高［37］，如CRT和LTRE，轉(zhuǎn)錄因子同樣是結(jié)合于這些順式元件上，AP2/ERF家族就是此類轉(zhuǎn)錄因子，家族蛋白成員很多，能激活調(diào)控許多逆境應(yīng)答基因．有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)同一個轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白可能響應(yīng)各自不同的非生物脅迫，例如在對擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)DREB1/CBF基因受冷處理誘導(dǎo)，但對干旱和高鹽脅迫不敏感;相反的是DREB2基因受干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)而不被低溫誘導(dǎo)［38］．

3 結(jié)束語

ABA與許多逆境反應(yīng)有關(guān)，逆境響應(yīng)基因的表達和調(diào)控．植物在應(yīng)對環(huán)境逆境時，植物體內(nèi)ABA含量上升，特別是在干旱逆境和鹽脅迫時．因此學(xué)習(xí)ABA水平的調(diào)節(jié)機制對于理解植物抗逆反應(yīng)非常重要．正如上所描述，植物中ABA的合成和分解酶類對植物耐逆性和種子休眠非常重要．這說明，我們可以利用一些與ABA合成或者代謝相關(guān)的酶來提高植物耐逆性，這些相關(guān)基因可以用來調(diào)節(jié)內(nèi)源ABA水平．如，過量表達ABA的合成途徑的關(guān)鍵基因或者抑制ABA代謝途徑的關(guān)鍵酶的合成，這些方法都可能導(dǎo)致內(nèi)源ABA的含量升高，體現(xiàn)在較強的耐逆性．

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