拜氏不動桿菌Y-2對苜蓿修復(fù)鹽堿土石油污染的影響*

郇菲菲，郭長虹

(哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室)

0 引言

石油工業(yè)的迅速發(fā)展在促進人類社會的進步和文明方面發(fā)揮著重要的作用，但同時也帶來了許多環(huán)境問題．據(jù)有關(guān)資料表明:在我國每年有將近60萬t原油進入環(huán)境，嚴(yán)重污染土壤、地下水、河流和海洋［1］．石油對土壤的污染多集中在20 cm左右的表層，石油進入土壤環(huán)境，其危害主要表現(xiàn)在兩個方面:(1)破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤通透性，損害植物根部，阻礙根的呼吸與吸收，最終導(dǎo)致植物死亡．(2)石油中某些污染物也會被植物吸收從而進入食物鏈，對人類的身體健康造成危害．因此加快石油污染土壤的治理是對于這樣一個人多地少的國家而言，顯得尤為迫切和重要．

植物修復(fù)是由植物介導(dǎo)的生物修復(fù)，它是一個利用植物自主去除、轉(zhuǎn)移、破壞污染物和沉淀物的過程．作為一種原位生物修復(fù)手段，它花銷更少并且對土壤結(jié)構(gòu)的影響更小，和其他手段相比更容易被公眾接受［2］．而植物和微生物聯(lián)合修復(fù)則利用植物體內(nèi)對某些污染物的積累、植物代謝對某些污染物的轉(zhuǎn)化和礦化功能，以及植物根際與根際微生物之間的相互促進關(guān)系，來加速土壤中污染物的降解［3］．

植物根際促生菌(Plant-growth-promoting-rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類可促進植物生長、防治病害、增加作物產(chǎn)量的有益菌類．PGPR對土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物都有生防作用，對植物吸收利用礦物質(zhì)營養(yǎng)有促進作用，并可以產(chǎn)生有益于植物生長的代謝產(chǎn)物，從而促進植物的生長發(fā)育［4］．近年來的研究表明，PGPR能夠有效促進植物修復(fù)土壤中的石油或其他污染［5-6］．

1 材料和方法

1．1 試驗材料

供試鹽堿土壤:采自大慶草原0～20 cm表層土．采集來的土壤經(jīng)在陰涼處自然風(fēng)干后，碾碎并去除里面的石頭和植物殘體等，過2 mm篩備用．人工石油污染土壤的制備:用石油醚將采自大慶油田的石油溶解，然后均勻拌入經(jīng)過處理后的鹽堿土壤，使其終濃度為5 g/kg干土，放在陰涼處使石油醚揮發(fā)，待石油醚揮發(fā)后備用．

供試植物:苜蓿(Medicago sativa L．)屬于多年生草本植物，對土壤要求不高，耐冷熱且抗病性較強．供試苜蓿種子用70%的酒精進行表面消毒1 min，然后用1%的次氯酸鈉浸泡10 min，再用滅菌蒸餾水清洗干凈．

供試Y-2菌種:為PGPR中的拜式不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii)(CGMCC No．6291)．它是本實驗室從大慶石油污染鹽堿地區(qū)的植物根際土壤中經(jīng)過培養(yǎng)基的定向篩選獲得，前期實驗表明它具有較高ACC脫氨酶活性和顯著促生效果，同時對石油具有一定的降解能力．

1．2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)0 g/kg和5 g/kg土壤石油濃度梯度，每盆裝土1．5 kg．下設(shè)兩個處理:(1)苜蓿單獨種植作為對照組CK;(2)苜蓿接種PGPR作為實驗組Y-2．每個處理重復(fù)3次．盆中澆透水后播種苜蓿(每盆100顆)，隔天澆水一次，Y-2接種菌懸液10 mL，生長期間溫度在25～30℃，光照時間為每天8～10 h，2個月后進行測定各項指標(biāo)．

1．3 測定方法

生物量采用烘干法測定．丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定［7］，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法［8］．土壤中總TPH含量測定參照USA EPA 3550．

1．4 統(tǒng)計分析

采用Excel和SPSS16．0系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析．采用方差分析(ANOVA)中的Duncan指數(shù)分析差異顯著性，其中不同字母表示差異顯著，反之則不顯著(p＜0．05)．

2 結(jié)果分析與討論

2．1 不同處理對苜蓿生物量的影響

表1 不同處理下苜蓿生物量的變化

根據(jù)表1可以看出石油脅迫使苜蓿生物量降低，說明石油對苜蓿生長產(chǎn)生了抑制作用．但是無論在無油還是有油條件下，與未接種相比，接種處理顯著提高地上地下干重．在5 g/kg石油污染土壤中，接種Y-2的處理地上干重比對照增加了 19．34%，地下干重比對照增加了38．91%．表明Y-2能夠顯著促進苜蓿的生長，增強植物的抗逆性，一定程度上消除脅迫對生物量的影響．

2．2 不同處理對苜蓿葉片丙二醛(MDA)含量的影響

圖1 接種Y-2后苜蓿丙二醛(MDA)含量

MDA是植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，它可以使細胞膜的酶蛋白發(fā)生交聯(lián)并失活，損傷細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，其水平的高低能夠間接反映自由基所致脂質(zhì)過氧化程度［9］．石油脅迫處理中接種Y-2處理與CK之間達到了顯著性差異，接種后降低了苜蓿植株的丙二醛含量，說明Y-2能緩解苜蓿植株細胞膜受脅迫傷害的程度，提高苜蓿的耐油性．

2．3 不同處理對苜蓿葉片可溶性蛋白含量的影響

圖2 不同處理下苜?？扇苄缘鞍缀?/p>

在石油脅迫下，無論CK還是接種Y-2的處理，均顯著低于無油脅迫的相應(yīng)處理，如圖2．說明石油抑制了蛋白的合成或加速了其降解．接種的植株可溶性蛋白含量均有不同程度的提高，提高幅度為15．6%左右．其中石油脅迫下接種Y-2處理已經(jīng)達到無脅迫下的CK水平，可能是由于Y-2能夠增強苜蓿的蛋白合成能力，延緩苜蓿蛋白的降解，維持蛋白正常代謝，降低苜蓿體內(nèi)氨類物質(zhì)對其產(chǎn)生的毒害，增強植物的抗逆能力．

2．4 不同處理下對苜蓿修復(fù)石油污染鹽堿土壤的影響

圖3 不同處理下的總石油烴的降解率

經(jīng)過60 d的修復(fù)過程，在石油污染土壤中，對照組CK的總石油烴的降解率為20．76%，而接種Y-2處理的總石油烴降解率為35．06%．接種Y-2顯著增加了總石油烴的降解率．表明接種Y-2能夠顯著促進苜蓿對于石油污染鹽堿土壤的石油降解．

3 結(jié)束語

通過測定苜蓿生長狀況包括地上、地下干重，以及丙二醛和可溶性蛋白含量，表明接種Y-2處理能夠緩解石油脅迫對苜蓿的影響，并且能明顯促進植物生長，同時接種處理減緩了石油脅迫對植物的毒害作用，增強植物的抗逆能力．最后測定了石油污染土壤中TPH的降解率，表明苜蓿結(jié)合Y-2進行石油污染土壤的修復(fù)比單獨種植苜蓿效果好．植物結(jié)合PGPR對于石油污染鹽堿土的石油烴降解是一種理想的組合．

［1］ 陸光華，萬蕾，蘇瑞蓮．石油烴類污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)研究進展［J］．生態(tài)環(huán)境，2003，12(2):220-223．

［2］ 孫鐵衍，宋玉芳，許華夏，等．植物法生物修復(fù)多環(huán)芳烴和礦物油污染土壤的調(diào)控研究［S］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，1999，10(2):225-229．

［3］ Langella F，Grawunder A，Stark R．Microbially assisted phytoremediation approaches for two multi-element contaminated sites［J］．Environ Sci Pollut R，2013:1-14．

［4］ Rathaur P，Raja W，Ramteke PW，et al．Effect of UV-B Tolerant Plant Growth Promoting Rhizobacteria(PGPR)on Seed Germination and Growth of Withania somnifera［J］．Advances in Applied Science Research，2012，3(3):1399-1404．

［5］ Huang X D，El-Alawi Y，Gurska J，et al．A multi-process phytoremediation system for decontamination of persistent total petroleum hydrocarbons(TPHs)from soils［J］．Microchem J，2005，81:139-47．

［6］ Gurska J，Wang W X，Gerhardt KE，et al．Three year field test of a plant growth promoting rhizobacteria enhanced phytoremediation system at a land farm for treatment of hydrocarbon waste［J］．Environ Sci Technol，2009，43(12):4472-4479．

［7］ 趙世杰，許長城，鄒琦，等．植物組織中丙二醛測定方法的改進［J］．植物生理學(xué)通訊，1991，30(3):207-210．

［8］ 華東師范大學(xué)．植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］．北京:人民教育出版社，1981．20-25．

［9］ 簡令成，王紅．逆境植物細胞生物學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，2009．