紅細(xì)胞生成素對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及其可能機(jī)制

陳艷霞，秦曉華，房向東，黃 翀，涂衛(wèi)平

0 引 言

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病全身微血管病變的一部分，是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，已成為終末期腎病的重要原因。既往認(rèn)為DN的主要病變部位在腎小球，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)高血糖對(duì)腎小管間質(zhì)損害方面發(fā)揮了更加重要的作用，高糖可介導(dǎo)間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，最終促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［1］。Rho激酶(ROCK)抑制劑 Y27632和法舒地爾阻斷糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可改善腎小球的通透性［2］、改善腎血流動(dòng)力學(xué)［3］、改善代謝指標(biāo)及延緩腎小球硬化進(jìn)展［4］、抑制活性氧自由基的形成［5］和減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積［6］。這些都意味著RhoA/ROCK信號(hào)通路在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)可抑制豬近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，阻止慢性腎疾病的進(jìn)展［7］，對(duì)腎損傷具有保護(hù)作用［8］，可顯著減輕大鼠體外循環(huán)腎損傷［9］，因此本實(shí)驗(yàn)選取高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(human kidney cells，HK-2)細(xì)胞模擬 DN，并探討EPO對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用，為延緩腎纖維化的進(jìn)展尋找新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 EPO(沈陽(yáng)三生惠贈(zèng))，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó) Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)，高糖、甘露醇、ROCK抑制劑Y27632(美國(guó)Sigma)，RNA抽提試劑 Trizol(美國(guó) Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(美國(guó) Fermentas)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金)，聚合酶鏈反應(yīng)引物由Invitrogen合成，鼠抗人單克隆平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin-α，α-SMA)抗體、鼠抗人單克隆E-cadherin抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠IgG(北京中杉金橋)，人FN定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(上海森雄)。

1.2 主要儀器 核酸微量蛋白測(cè)定儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，DYPC-31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)，熒光顯微鏡(日本Olym-pus)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院余學(xué)清教授惠贈(zèng)。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)傳代入6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，至80%融合后改用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基同步24h。按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)組(高糖終濃度30 mmol/L)、甘露醇對(duì)照組(甘露醇濃度24.5 mmol/L)、EPO對(duì)照組(EPO終濃度為20 U/mL)、5 U/mL EPO干預(yù)組、10 U/mL EPO干預(yù)組、20 U/mL EPO干預(yù)組(干預(yù)組均含高糖30 mmol/L)、ROCK抑制劑(Y27632)組(Y27632終濃度為 30 μmol/L，加入 Y27632 30 min后加高糖，高糖終濃度為30 mmol/L)，以上各組均培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 干預(yù)后培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用Trizol分別提取各組細(xì)胞總的RNA，檢測(cè)RNA完整性后用核酸微量蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度。取總 RNA 1.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴(kuò)增目標(biāo)基因(以人β-actin為內(nèi)參照)，總反應(yīng)體系50 μL。RhoA的引物序列:正義鏈5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'，反 義 鏈 5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物356bp。ROCK1 的引物序列:正義鏈5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3'，反義鏈5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物293 bp。β-actin的引物序列:正義鏈5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反義鏈 5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物434 bp。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性5 min，55℃退火30 s，72℃延伸7 min，共35個(gè)循環(huán)。配制2%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物電泳儀內(nèi)120 V，30 min完成電泳后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 細(xì)胞免疫熒光 6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞在4℃下用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%Triton穿孔15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫封閉30 min后各孔中滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體(抗體按1∶200稀釋，5%BSA封閉液配制)或鼠抗人單克隆E-鈣黏蛋白抗體4℃冰箱孵育過(guò)夜后取出室溫恢復(fù)30 min，加入FITC標(biāo)記抗小鼠IgG二抗置37℃孵箱孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細(xì)胞選取10個(gè)視野攝像，熒光圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個(gè)視野累計(jì)光密度值與測(cè)量面積的比值為平均熒光強(qiáng)度(即蛋白相對(duì)表達(dá)量)。

1.6 ELISA法檢測(cè)纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)收集細(xì)胞上清液后嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，讀取波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品FN表達(dá)濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩組間比較用LSD法，若方差不齊用秩和檢驗(yàn)。變量間的比較采用Pearson直線相關(guān)分析，以 P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖、EPO 對(duì) RhoAmRNA、ROCK1 mRNA表達(dá)的影響 高糖誘導(dǎo)組RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，EPO干預(yù)組 RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA較空白對(duì)照組的表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與EPO濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。見表1、圖1。

2.2 RhoA mRNA與ROCK1 mRNA相關(guān)性分析直線相關(guān)分析顯示高糖誘導(dǎo)組，5、10、20 U/mL EPO干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA呈正相關(guān)(r=0.907，P=0.046，r=0.899，P=0.041;r=0.862，P=0.021;r=0.832，P=0.007)。

2.3 高糖、EPO對(duì)α-SMA、E-鈣黏蛋白及FN的蛋白表達(dá)影響 空白對(duì)照組弱表達(dá)α-SMA，高表達(dá)E-鈣黏蛋白;高糖誘導(dǎo)組α-SMA表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上升(P＜0.05)，E-鈣黏蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組顯著下降(P＜0.05);EPO干預(yù)組及ROCK抑制劑組E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組明顯增加，而α-SMA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，并且隨EPO濃度的升高作用下降更加顯著。ELISA結(jié)果顯示EPO干預(yù)組及ROCK抑制劑組FN表達(dá)較高糖誘導(dǎo)組顯著下降(P＜0.05)，且下降程度與EPO濃度相關(guān)。見表2。

圖1 各組細(xì)胞RhoAmRNA及ROCK1 mRNA的表達(dá)情況Figure 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups

表1 各組細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

表1 各組細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，#P＜0.05;與5 U/mL EPO干預(yù)組比較，△P＜0.05;與10 U/mL EPO干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

組別 n 0.945 ±0.131 51.007 ±0.002高糖誘導(dǎo)組 3 1.400 ±0.022*# 1.913 ±0.011*#甘露醇對(duì)照組 3 0.952 ±0.004 1.003 ±0.002 EPO 對(duì)照組 3 0.945 ±0.011 1.004 ±0.002 5 U/mL EPO 干預(yù)組 3 0.278 ±0.006*# 1.418 ±0.006*#10 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.770 ±0.005*#△ 0.919 ±0.004*#△20 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.334 ±0.009*#△▲ 0.477 ±0.002*#△▲ROCK 抑制劑組 3 1.390±0.002*#△ 0.249±0.005*#△▲RhoA mRNA ROCK1 mRNA空白對(duì)照組3

表2 各組細(xì)胞α-SMA、E-鈣黏蛋白、FN的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA，E-cadherin，F(xiàn)N in different groups(±s)

表2 各組細(xì)胞α-SMA、E-鈣黏蛋白、FN的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA，E-cadherin，F(xiàn)N in different groups(±s)

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與10 U/mL EPO干預(yù)組比較，#P＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，△P＜0.05;與5 U/mL EPO干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

組別 n α-SMA E-鈣黏蛋白 FN(ng/mL)0.224 ±0.006 0.644 ±0.006 2582.50 ±87.20高糖誘導(dǎo)組 3 0.335 ±0.006* 0.107 ±0.004* 14545.53 ±317.27*甘露醇對(duì)照組 3 0.223 ±0.082 0.645 ±0.006 2434.63 ±198.76 EPO 對(duì)照組 3 0.225 ±0.006 0.645 ±0.008 2512.97 ±205.27 5 U/mL EPO 干預(yù)組 3 0.285±0.005＊△ 0.236±0.006＊△▲ 11273.73±597.17＊△▲10 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.273±0.007＊△▲ 0.433±0.010＊△▲ 6690.70±380.76＊△▲20 U/mL EPO干預(yù)組 3 0.243±0.006*#△▲ 0.521±0.010*#△▲ 5252.70 ±179.23*#△▲ROCK 抑制劑組 3 0.235±0.006*#△▲ 0.357±0.006*#△▲ 3252.13±197.08*#△▲空白對(duì)照組3

3 討 論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，DN是由于血流動(dòng)力學(xué)及代謝因素引起的，現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)支持，慢性微炎癥狀態(tài)及免疫系統(tǒng)的激活也是DN的發(fā)病機(jī)制之一［10］。EPO是一種多功能的細(xì)胞因子，不僅具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用，同時(shí)還有抗凋亡［11］及免疫調(diào)節(jié)作用［12］。對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的研究發(fā)現(xiàn)，EPO還具有抗炎的作用［13］。在DN中，高糖主要是通過(guò)刺激某些細(xì)胞因子產(chǎn)生和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成而發(fā)揮效應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生EMT。EMT的主要特點(diǎn)是具有上皮細(xì)胞標(biāo)志的E-鈣黏蛋白丟失和間充質(zhì)特征的α-SMA、間質(zhì)基質(zhì)組分如FN的表達(dá)。Patel等［14］也證實(shí)在 EMT過(guò)程中，Rho的激活是一個(gè)關(guān)鍵性的步驟。Brownlee等［15］提出細(xì)胞對(duì)葡萄糖-誘導(dǎo)毒性的敏感性依賴于其吸收機(jī)制及高糖環(huán)境下的調(diào)節(jié)能力。然而腎小管上皮細(xì)胞無(wú)法減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)從而減少細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生的形態(tài)及功能的改變。腎小管上皮細(xì)胞吸收葡萄糖是不受胰島素水平調(diào)節(jié)的，因此，在高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖水平更敏感。本實(shí)驗(yàn)以高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞模擬DN模型，探討紅細(xì)胞生成素對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。本研究證實(shí)高糖可通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，給予RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑Y27632后腎纖維化指標(biāo)發(fā)生顯著改變，高糖誘導(dǎo)組熒光結(jié)果顯示E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著下降，α-SMA的蛋白表達(dá)顯著上升，ELISA結(jié)果亦提示細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分FN的蛋白表達(dá)明顯增多，我們的研究表明，高糖可誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞發(fā)生 EMT并激活RhoA/ROCK信號(hào)通路，RhoA/ROCK通路參與高糖誘導(dǎo)的EMT，與Gu等［16］研究結(jié)果一致。給予EPO干預(yù)后，E-鈣黏蛋白表達(dá)相對(duì)增多，α-SMA的蛋白表達(dá)相對(duì)減少，F(xiàn)N表達(dá)相對(duì)減少，說(shuō)明給予EPO干預(yù)后減輕了EMT過(guò)程，從而顯示出EPO對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程具有保護(hù)作用。Person直線相關(guān)分析顯示高糖誘導(dǎo)組及EPO干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA呈正相關(guān)，推測(cè)其保護(hù)作用與RhoA/ROCK通路有關(guān)。因本實(shí)驗(yàn)顯示，給予高糖刺激后，RhoA mRNA及ROCK mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，加入EPO干預(yù)后，其表達(dá)隨EPO濃度的增加而逐漸減弱。EPO通過(guò)RhoA/ROCK通路發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可能與EPO的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EPO可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，為DN患者的治療帶來(lái)新的希望。然而目前國(guó)內(nèi)外研究對(duì)DN患者EPO延緩腎纖維化作用在臨床上使用的量及使用時(shí)間等問(wèn)題均未有明確的觀點(diǎn)。EPO的潛在毒性作用如高血壓、充血性心力衰竭、血栓甚至可能阻滯腫瘤細(xì)胞的凋亡等也限制其在臨床的使用［17］。相信隨著EPO研究的不斷深入，EPO對(duì)DN患者的治療作用指日可待。

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