神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)顱腦外傷大鼠的抗炎作用機(jī)制

呂秋石，郭芮兵，姜永軍，葉瑞東，樊新穎，馬敏敏，李 蕓，徐格林，劉新峰

0 引 言

顱腦外傷(traumatic brain injury，TBI)會(huì)引發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，從而致殘或者致死［1-2］。TBI所致的損害可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，后者更為嚴(yán)重，主要包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的壞死和凋亡以及蛋白變性或異常沉積等［3］。因而積極控制外傷后的炎癥反應(yīng)，有益于改善預(yù)后［4-5］。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)可減輕大鼠腦外傷后的相關(guān)損傷［6-7］，但其相對(duì)分子質(zhì)量大，難以通過(guò)血腦屏障，腦組織內(nèi)利用率低，經(jīng)鼻給藥方式可繞過(guò)血腦屏障作用［8-9］。本研究旨在討論經(jīng)鼻給予NGF對(duì)TBI大鼠炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年雄性 SD大鼠，體重280～310 g，共36只，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(軍)2007-09。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)。造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、TBI模型組、治療組，每組12只。兔抗大鼠β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ42)多克隆抗體(1∶100，Abcam公司，美國(guó))，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國(guó))，生物素化的山羊抗兔IgG二抗(1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國(guó))，ELISA試劑盒(均由法國(guó)Diaclone公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立腦外傷模型 TBI模型組和治療組采用Feeney等［10］的自由落體法。大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上，將撞桿置于已暴露的右側(cè)硬膜上，2%水合氯醛以40 mg/kg劑量行腹腔內(nèi)麻醉后，用40 g砝碼從25cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，撞擊后用骨蠟封閉骨窗。假手術(shù)組不致傷，僅開(kāi)顱窗后用骨蠟封閉。

1.2.2 經(jīng)鼻給藥 參照 Liu等［11］的經(jīng)鼻給藥方法，采用兩側(cè)鼻孔交替給藥，當(dāng)一側(cè)鼻腔給藥時(shí)，將另一側(cè)鼻腔關(guān)閉，每次間隔約2 min，單次給藥約5 μL。治療組大鼠 TBI后6 h經(jīng)鼻給予 NGF(50 g/d)，TBI模型組及假手術(shù)組則經(jīng)鼻給予等量磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4 ～7.5)，每天給藥 1 次，持續(xù)給藥至大鼠被處死。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)Aβ42表達(dá)變化 各組大鼠分別于TBI后12 h和24 h各處死6只，取傷側(cè)皮質(zhì)周?chē)慕M織研磨勻漿后提取總蛋白，并檢測(cè)蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，利用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后孵育一抗，4℃過(guò)夜。經(jīng)PBST洗滌后加二抗，室溫下孵育1 h。化學(xué)發(fā)光后曝光顯影。結(jié)果分析使用Image J軟件。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)IL-1β和TNF-α 蛋白準(zhǔn)備同免疫印跡法，操作根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)NF-κB活性 細(xì)胞核蛋白提取參照先前實(shí)驗(yàn)方法［12］。EMSA檢測(cè)方法參照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行:取1.75 pmol/μL未標(biāo)記的雙鏈NF-κB 寡 核 苷 酸 探 針 (5'-AGTTGAGGGGACTrrCCCAGGC-3';5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3')和T4多核苷酸激酶，用［γ-32P］ATP(0.37 GBq/mL)進(jìn)行標(biāo)記，總反應(yīng)體積為25 μL(核蛋白3 μL，多聚腺苷酸一尿苷酸2 μL，［γ-32P］ATP 標(biāo)記的 NF-κB 探針2μL，反應(yīng)液18μL)，混勻后室溫放置20 min，上樣于聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，恒壓150 V電泳。電泳結(jié)束后輕輕揭下凝膠，放入暗盒中-70℃曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey's post hoc法，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織的炎癥反應(yīng) TBI后12 h和24 h，TBI模型組和治療組大鼠傷側(cè)皮質(zhì)內(nèi)炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)量均較假手術(shù)組大鼠明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)鼻給予NGF后，TBI治療組 IL-1β、TNF-α 的表達(dá)量較 TBI模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠腦組織內(nèi)NF-κB的表達(dá) EMSA結(jié)果提示，TBI后 12 h、24 h，TBI模型組大鼠傷側(cè)皮質(zhì)內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性較假手術(shù)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)鼻給予NGF后，治療組大鼠NF-κB DNA結(jié)合活性較TBI模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠腦組織內(nèi)Aβ42的表達(dá) TBI后12h、24h，TBI模型組大鼠傷側(cè)皮質(zhì)內(nèi)Aβ42的表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而經(jīng)鼻給予NGF治療后，大鼠傷側(cè)皮質(zhì)內(nèi)的Aβ42表達(dá)較TBI模型組大鼠均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠傷側(cè)皮質(zhì)炎癥因子表達(dá)的比較(±s，n=6)Table 1 The expression of inflammation in the cortex in all group(±s，n=6)

表1 各組大鼠傷側(cè)皮質(zhì)炎癥因子表達(dá)的比較(±s，n=6)Table 1 The expression of inflammation in the cortex in all group(±s，n=6)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與 TBI模型組比較，#P＜0.05

IL-1β(pg/mg)TNF-α(pg/mg)NF-κB組別Aβ 24h假手術(shù)組 4.98±1.88 5.49±2.00 4.08±1.42 4.17±0.97 104.97±0.85 105.63±0.91 0.557±0.006 0.930±0.0傷后12h 傷后24h 傷后12h 傷后24h 傷后12h 傷后24h 42傷后12h 傷后15 TBI模型組 70.65±3.10* 68.85±8.10* 47.12±7.38* 56.15±11.20* 135.26±0.60* 149.86±0.49* 0.827±0.009* 1.390±0.010*治療組 37.51±1.92*# 36.23±2.99*# 27.63±5.77*# 29.94±8.62*# 111.62±0.49*# 131.52±0.88*# 0.230±0.008*# 0.520±0.004*#

3 討 論

我們的研究結(jié)果表明，經(jīng)鼻給予NGF可抑制TBI后大鼠腦組織內(nèi)Aβ42的增加，從而抑制其下游的NF-κB通路，使得炎癥因子 IL-1β、TNF-α 的表達(dá)下降，最終炎癥反應(yīng)下調(diào)，可能改善TBI后大鼠的預(yù)后情況。

積極控制TBI后的炎癥反應(yīng)有助于預(yù)后的改善。炎癥因子IL-β表達(dá)的增高可促進(jìn)GSK-3β的活化，后者進(jìn)一步促進(jìn)tau蛋白的異常磷酸化，最終向阿爾茲海默癥發(fā)展［13］。另外，炎癥因子 IL-1β、TNF-α 的增加，會(huì)引起水通道蛋白-4(aquaporins-4，AQP-4)的表達(dá)增加，加劇TBI后的腦水腫情況［14-15］。因此，炎癥反應(yīng)與TBI的預(yù)后緊密相關(guān)。本文結(jié)果顯示，經(jīng)鼻給予NGF后，TBI大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子的表達(dá)明顯下降。

NF-κB 是炎癥反應(yīng)的調(diào)控因子［16］，NGF 通過(guò)抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性從而抑制TBI大鼠的炎癥反應(yīng)。NGF對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)作用目前仍無(wú)明確的定論，有文獻(xiàn)指出NGF通過(guò)與p75NTR受體結(jié)合介導(dǎo)NF-κB的激活［17-18］。本組結(jié)果提示經(jīng)鼻給予 NGF后，TBI大鼠的NF-κB的DNA結(jié)合活性是下降的，這一作用可能與Aβ42表達(dá)的下調(diào)有關(guān)，NGF可減少腦損傷后大鼠腦組織內(nèi) Aβ42的表達(dá)［19-20］，Aβ42的下調(diào)可抑制NF-κB激活的［21-23］。本結(jié)果也表明經(jīng)鼻給予NGF后，TBI大鼠的Aβ42的表達(dá)減少。有研究表明，炎癥反應(yīng)會(huì)增加TBI后大鼠腦內(nèi)Aβ42的沉積［24］，可見(jiàn)Aβ42與NF-κB之間是相互作用的。

綜上所述，經(jīng)鼻給予NGF可控制TBI大鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，該作用機(jī)制可能與Aβ42/NF-κB通路相關(guān)。TBI后的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)Aβ42的沉積、tau蛋白的異常磷酸化、AQP-4的升高等，引發(fā)相應(yīng)的并發(fā)癥，通過(guò)控制炎癥反應(yīng)，從而可能使預(yù)后得到改善，但應(yīng)用到臨床治療，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

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