姜黃素抑制RPMI8226細(xì)胞增殖時(shí)絲裂原活化蛋白激酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)

朱國(guó)華，張 琦，戴海萍，沈 群

0 引 言

姜黃素(curcumin，Cur)是從亞熱帶地區(qū)多年生草本植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，具有多方面藥理作用，如抗腫瘤、抗炎和抗氧化等［1-2］。其中Cur的抗腫瘤作用日益受到學(xué)者們的關(guān)注，美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥［3］。而多發(fā)性骨髓瘤是一種起源于B淋巴細(xì)胞并能分泌大量單克隆免疫球蛋白的惡性漿細(xì)胞病。目前因其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜以及多藥耐藥的出現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤仍是一種難治性疾病，尚需探索新的治療藥物［4］。本研究探討Cur體外抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖時(shí)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen actived protein kinase，MAPKs)及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族的表達(dá)，初步揭示其可能的抗腫瘤分子機(jī)制，為臨床多發(fā)性骨髓瘤治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 RPMI8226細(xì)胞株由江蘇省人民醫(yī)院惠贈(zèng);Cur購(gòu)于Sigma公司，純度≥94%;MTT試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司;PI染色細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品;一抗P38 MAPK、JNK、ERK1/2、p-JNK、β-actin 均購(gòu)自 Cell Signaling公司;明膠購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 RPMI8226細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，并置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。Cur溶解于DMSO中配制成50 mg/mL儲(chǔ)存液，-20oC保存，使用時(shí)用無血清培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，以1×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90 μL。培養(yǎng)2 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度的Cur，同時(shí)設(shè)立不加藥的陰性對(duì)照組及不含細(xì)胞的空白組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 工作液 50 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，再每孔加入150 μL DMSO，振蕩器振蕩搖勻10 min，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)吸光度值(A490)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式如下:

細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-［(實(shí)驗(yàn)組A490-空白組A490)/(陰性對(duì)照組A490-空白組A490)］×100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，按5×105/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2.25mL，再分別加入Cur 250μL(終濃度為6.25μmol/L、12.50μmol/L、25.00μmol/L)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;培養(yǎng)48 h后離心收集1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次后將細(xì)胞固定于預(yù)冷的70%乙醇，4℃過夜，離心洗滌后加入500 μL PI染色工作液，并于37℃避光水浴30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白MAPKs家族的表達(dá) 收集不同濃度 Cur(終濃度為6.25 μmol/L、12.50μmol/L、25.00 μmol/L)處理 72 h 后的各組RPMI8226細(xì)胞，PBS洗滌2次后加入適量RAPI裂解液和相關(guān)磷酸酶、蛋白酶抑制劑，冰浴30 min，4℃ 12000×g離心15 min后取上清。酶標(biāo)儀測(cè)A570值，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組上清中的蛋白濃度。每組各取40 μg變性后的蛋白質(zhì)樣品，行SDS-PAGE垂直電泳，半干電轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h后加入一抗，4℃搖床過夜;以TBST漂洗后加入二抗，常溫作用2 h，再經(jīng)TBST漂洗后加入ECL發(fā)光液，Image Quant LAS 4000成像儀檢測(cè)并保存結(jié)果。Photoshop 6.0軟件分析所得條帶，計(jì)算目的基因與β-actin的灰度比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。

1.6 明膠酶譜法檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白酶MMPs家族的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，接種于RPMI-1640無血清培養(yǎng)液，并加入不同濃度的Cur(終濃度為 6.25 μmol/L、12.50 μmol/L、25.00 μmol/L)。培養(yǎng)48h后離心收集各組無血清培養(yǎng)上清液，并測(cè)定上清樣本中的蛋白濃度。配置含0.1%明膠的SDSPAGE膠，并按照每孔40 μg蛋白量上樣，4℃ 100 V恒流電泳1.5h，至溴酚藍(lán)染料到達(dá)膠底。取出凝膠依次置于洗脫液、漂洗液中振蕩洗滌，再置于孵育緩沖液(含0.02%Brij-35)，37℃孵育42 h;取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色3h，再經(jīng)脫色液逐漸脫色至藍(lán)色背景下顯現(xiàn)清晰白色條帶為止。拍照，并經(jīng)Photoshop 6.0軟件分析酶解條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1 RPMI8226細(xì)胞增殖抑制率變化 MTT結(jié)果提示(6.25～25.00)μmol/L濃度范圍內(nèi)的 Cur對(duì)RPMI8226細(xì)胞均有增殖抑制作用，隨著藥物濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制率逐漸上升，見圖1。經(jīng)單因素方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)上不同濃度Cur對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制率與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。另外經(jīng)LD 50計(jì)算軟件分析得出Cur作用于RPMI8226細(xì)胞24 h、48 h及72 h的IC50值分別為15.80、12.77 和 11.02 μmol/L。

圖1 不同濃度Cur對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖抑制的影響(n=3)Figure 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin(cur)on the proliferation of RPMI 8226 cells(n=3)

2.2 RPMI8226細(xì)胞周期變化 Cur作用RPMI8226細(xì)胞48h，隨著藥物濃度的升高，處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸減少，S期細(xì)胞數(shù)逐漸增多，且G2/M期細(xì)胞數(shù)也逐漸增多，見表1。經(jīng)單因素方差分析得出，不同Cur濃度組G0/G1期細(xì)胞數(shù)及G2/M期細(xì)胞數(shù)的組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而S期細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此提示 Cur體外抑制RPMI8226細(xì)胞增殖，影響RPMI8226細(xì)胞周期進(jìn)程，且使細(xì)胞主要阻滯于G2/M期。

表1 Cur作用RPMI8226細(xì)胞48h后細(xì)胞周期的改變(±s，%，n=3)Table 1 Cell cycle changes of RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)for 48 hours(±s，%，n=3)

表1 Cur作用RPMI8226細(xì)胞48h后細(xì)胞周期的改變(±s，%，n=3)Table 1 Cell cycle changes of RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)for 48 hours(±s，%，n=3)

與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期陰性對(duì)照組50.67 ±1.28 44.54 ±0.85 4.79 ±0.15 Cur 6.25 μmol/L 44.06 ±1.39* 50.06 ±1.81 5.89 ±0.41*Cur 12.50 μmol/L 39.80 ±1.27* 52.12 ±1.53 8.09 ±0.63*Cur 25.00 μmol/L 34.39 ±1.89* 52.89 ±2.17 12.72 ±0.68*

2.3 凋亡相關(guān)蛋白MAPKs家族的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，不同濃度Cur處理RPMI8226細(xì)胞72 h，隨著細(xì)胞凋亡率的不斷增加，JNK1/2/3和p-JNK1/2/3的表達(dá)呈濃度依賴性上升，與陰性對(duì)照組相比，除Cur 6.25μmol/L處理無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各濃度均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或P＜0.01);而ERK1/2及P38 MAPK的表達(dá)與陰性對(duì)照組相比則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖2、圖3。

2.4 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMPs的表達(dá) 明膠酶譜法分析不同濃度Cur處理RPMI8226細(xì)胞48 h后細(xì)胞上清中的明膠酶，結(jié)果可見在藍(lán)色背景下出現(xiàn)2條相對(duì)分子質(zhì)量分別為72 000、92 000的溶解帶，分別是酶原形式的MMP-2(Pro-MMP-2，72000)及酶原形式的 MMP-9(Pro-MMP-9，92 000)，見圖4。后經(jīng)Phtoshop灰度掃描并統(tǒng)計(jì)分析，MMP-2和MMP-9的表達(dá)呈藥物濃度依賴性下降，與陰性對(duì)照組相比，Cur 12.50 μmol/L 和 Cur 25.00 μmol/L 處理后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖5。

圖2 Cur作用RPMI8226細(xì)胞72 h后MAPKs的表達(dá)Figure 2 Expressions of JNK1/2/3，p-JNK1/2/3，ERK1/2and P38-MAPK in RPMI8226 cells treated with curcumin for 72 hours

圖3 Cur作用RPMI8226細(xì)胞后MAPKs表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Figure 3 Protein expression of MAPKs/β-acti in RPMI8226 cells treated with different concentrations of curcumin(cur)

圖4 Cur作用RPMI8226細(xì)胞48 h后細(xì)胞上清中MMPs的表達(dá)Figure 4 Zymogen expressions of MMP-2 and MMP-9 in RPMI8226 cell supernatant treated with curcumin for 48 hours

圖5 Cur作用RPMI8226細(xì)胞后細(xì)胞上清中MMPs表達(dá)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Figure 5 Zymogen expressions of MMP-2 and MMP-9 in RPMI8226 cell supernatant treated with different concentrations of curcumin(cur)

3 討 論

MAPKs家族主要包括3個(gè)成員:ERK1/2、JNK和P38 MAPK，是將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)或核內(nèi)的重要使者，引起諸如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等生物學(xué)事件［5-6］。其中ERK1/2通常被認(rèn)為參與Ras-Raf-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用，并可阻止細(xì)胞凋亡。而JNK與P38MAPK同屬應(yīng)激激活的蛋白激酶，在紫外線照射及藥物刺激作用下發(fā)生活化［7］?；罨蟮腏NK可磷酸化c-Jun，活化轉(zhuǎn)錄因子-2，激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，且使FasL表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生外源性死亡受體途徑的凋亡;另外活化的JNK還可磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，促進(jìn)線粒體釋放Cyto C，從而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性線粒體途徑的凋亡［8］。而P38 MAPK信號(hào)通路一般認(rèn)為與JNK具有相同底物，可增強(qiáng)c-myc表達(dá)、p53磷酸化，在Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮類似作用［9-10］。

本研究將 6.25 ～25.00 μmol/L Cur體外作用于RPMI8226細(xì)胞，胞內(nèi)JNK1/2/3和p-JNK1/2/3的表達(dá)均呈濃度依賴性上升;而ERK1/2及P38 MAPK的表達(dá)與陰性對(duì)照組相比均無明顯改變。表明MAPKs家族的3個(gè)成員中，可能僅JNK參與Cur誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞的凋亡過程，其具體分子機(jī)制還有待對(duì)JNK信號(hào)通路上下游分子的進(jìn)一步研究，如需要進(jìn)一步檢測(cè)ASK1、MEK、MKK4/7、Fas/FasL、p53、caspase3/8/9 等蛋白的表達(dá)［11］。

另外MMPs是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶家族，其中明膠酶MMP-2與MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)的主要作用者，與腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切［12-13］。而近年來也有研究表明，一定濃度的Cur可抑制實(shí)體腫瘤細(xì)胞如腎癌786-O、卵巢癌細(xì)胞CaOV3、食管癌EC9706等的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［14-15］。本研究通過明膠酶譜法檢測(cè)到RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2及MMP-9的活性呈Cur藥物濃度依賴性下降，表明一定濃度的Cur還可能抑制RPMI8226細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移?？傊?，本研究證實(shí) Cur在6.25～25.00μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)RPMI8226細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，阻滯RPMI8226細(xì)胞于G2/M期。其具體的抗腫瘤機(jī)制，一方面可能激活MAPKs家族的JNK信號(hào)通路，體外誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞的凋亡;另一方面 Cur還可能通過抑制 MMPs的活性，影響RPMI8226細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。

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