青島近海多棘海盤車繁殖生物學(xué)的初步研究*

張秀梅，李淑蕓，劉 佳，吳桑桑，李文濤

（中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003）

多棘海盤車（Asteriasamurensis）俗稱海星，隸屬于棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）、海星綱（Asteroidea）、鉗棘目（Forcipulatida）、海盤車科（Asteriidae）、海盤車屬（Asterias），廣泛分布于北太平洋和澳大利亞沿海，為我國(guó)黃渤海習(xí)見種［1］。其喜食貝類，是底棲生物群落中重要的捕食者，大量聚集時(shí)對(duì)扇貝、魁蚶、牡蠣、鮑魚等貝類養(yǎng)殖和底播增殖造成嚴(yán)重危害［2－5］。國(guó)內(nèi)外對(duì)海盤車屬生物種類繁殖方面的研究主要集中在受精作用的頂體反應(yīng)［6］及激活機(jī)制［7－8］、環(huán)境因素對(duì)受精、胚胎發(fā)育的影響［9－10］以及配子的超微結(jié)構(gòu)［11］等方面，對(duì)多棘海盤車性腺發(fā)育、繁殖規(guī)律的研究?jī)H見于日本、俄羅斯、澳大利亞等少數(shù)報(bào)道［3，12－14］，且研究結(jié)果不盡一致。俄羅斯彼得大帝灣的多棘海盤車一年繁殖2次，日本沿海和澳大利亞近海的種類一年繁殖1次，而我國(guó)沿海多棘海盤車的周年內(nèi)繁殖規(guī)律還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)逐月采集的多棘海盤車樣本，采用常規(guī)生物學(xué)測(cè)定、解剖觀察、組織學(xué)切片等方法，研究不同發(fā)育時(shí)期的性腺結(jié)構(gòu)變化及配子發(fā)育特征，研究結(jié)果將豐富海星繁殖生物學(xué)基礎(chǔ)資料，為貝類底播增養(yǎng)殖和人工魚礁區(qū)敵害生物防除提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本及環(huán)境數(shù)據(jù)收集

實(shí)驗(yàn)所用的多棘海盤車樣本為2011年6月～2012年5月在青島浮山灣（36°01′N～36°04′N，120°22′E～120°68′E）沿岸海域潛水隨機(jī)采捕。浮山灣位于膠州灣東側(cè)，東臨燕兒島，西至太平角，灣口向南為黃海。每月取樣1次，每次取30～60只，繁殖期10～15d取樣1次，每次取樣10～30只，共取樣525只。各月海水表層水溫?cái)?shù)據(jù)來源于青島市海洋與漁業(yè)局海洋水文預(yù)報(bào)（http：//ocean.qingdao.gov.cn），日照長(zhǎng)度數(shù)據(jù)來源于日出日落時(shí)刻查詢網(wǎng)站（青島地區(qū)）觀測(cè)數(shù)據(jù)（http：//sunrise.supfree.net）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)測(cè)定 樣本運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后放至水族箱內(nèi)，待腕完全伸展后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。多棘海盤車結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。用游標(biāo)卡尺和電子天平分別測(cè)定輻徑、間輻徑、體高（精確到0.01mm）、體重（精確到0.01g）等生物學(xué)指標(biāo)。用解剖剪沿多棘海盤車腹面步帶區(qū)剪開，并稍稍用力將兩側(cè)掰開，露出性腺和消化腺，測(cè)量性腺和消化腺長(zhǎng)度，用鑷子小心取出二者后，分別測(cè)定其凈重量，并記錄性腺的顏色變化及發(fā)育狀況。

1.2.2 組織切片及顯微觀察 解剖后取出性腺，Bouin氏液固定。常規(guī)石蠟切片后，Nikon Eclipse LV100POL顯微鏡下觀察并拍照。各月分別取雌性、雄性個(gè)體各10～15只進(jìn)行組織學(xué)切片，繁殖期內(nèi)每個(gè)樣本隨機(jī)選取30個(gè)視野進(jìn)行拍照，借助測(cè)微尺和Image J軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中所有包含細(xì)胞核的卵母細(xì)胞最大直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

多棘海盤車性腺分期方法主要參照Vevers［16］和Byrne［3］的分期方法。結(jié)合性成熟系數(shù)法與組織學(xué)方法將性腺發(fā)育分為6期。其中卵巢（Ovary）的發(fā)育分期主要根據(jù)卵巢組織學(xué)切片上面積比例超過50%或比例相對(duì)高的卵母細(xì)胞的時(shí)相來確定。精巢（Testis）分期主要依據(jù)生殖上皮中的生精細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)、內(nèi)腔中精細(xì)胞的數(shù)量、血細(xì)胞層的發(fā)展程度等特點(diǎn)。

圖1 多棘海盤車結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of Asterias amurensis

性成熟系數(shù)和消化腺指數(shù)計(jì)算方法：

性成熟系數(shù)（GI）＝性腺重量/體重×1000‰；

消化腺指數(shù)（PI）＝消化腺重量/體重×100%。

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各月的GI和PI進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)不同月份間的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較，以P＜0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 卵巢

2.1.1 解剖學(xué)特征 多棘海盤車的卵巢包括5對(duì)，每腕1對(duì)。分枝成葡萄叢狀，分別位于間步帶區(qū)腕的基部?jī)蓚?cè)。無交配器官，也無其他附屬腺體。腕中每個(gè)卵巢各有生殖管并以小孔開口于反口面的兩腕之間。生殖腺與圍血系統(tǒng)的生殖圍血竇、反口面環(huán)血竇以及反口面神經(jīng)系統(tǒng)緊密結(jié)合在一起。卵巢的體積隨季節(jié)變化很大，在非生殖季節(jié)一般細(xì)小，分枝少，且精、卵巢外觀相同，不易分辨雌雄。而在生殖季節(jié)，卵巢為橙紅色，呈葡萄狀，膨大、充滿體腔，并一直深達(dá)腕末端，輕輕擠壓卵巢會(huì)有淡黃色漿體滲出。

2.1.2 卵巢發(fā)育分期及對(duì)應(yīng)的形態(tài)特征 多棘海盤車的卵巢結(jié)構(gòu)是海盤車科的典型結(jié)構(gòu)，由內(nèi)、外2層囊狀結(jié)構(gòu)與生殖腔相分離。雙層囊結(jié)構(gòu)在產(chǎn)卵后以及卵黃發(fā)生前期的個(gè)體中比較明顯，此時(shí)，卵巢壁較厚且呈收縮狀態(tài)。參照 Vevers［16］和 Byrne［3］的分期方法，根據(jù)多棘海盤車卵巢的外觀特征、組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和性成熟系數(shù)等將卵巢發(fā)育的周年變化分為6期。除成熟期可以通過外觀橙紅色及解剖后有淺黃色漿體滲出可以區(qū)分雌雄外，其他期的卵巢都需要組織學(xué)方法確定雌雄及發(fā)育程度。

組織學(xué)結(jié)構(gòu)的主要分期特征是卵母細(xì)胞的數(shù)量、大小、位置和著色情況，核徑、核仁數(shù)目，卵巢壁的寬度，液泡、卵黃粒、濾泡膜等形態(tài)特征，血細(xì)胞層的發(fā)育程度，吞噬細(xì)胞、細(xì)胞碎片的存在情況等。卵黃發(fā)生前卵母細(xì)胞嗜堿性較強(qiáng)，卵黃沉積后卵母細(xì)胞逐漸變成嗜伊紅性。各期的主要特征如下：

Ⅰ期：卵巢尚未發(fā)育。

卵巢透明且小，長(zhǎng)度一般小于0.5cm，寬度小于0.15cm。緊貼于間步帶區(qū)腕基部?jī)蓚?cè)。

組織學(xué)切片顯示卵巢中偶見無卵黃的初級(jí)卵母細(xì)胞（見圖2a）。卵母細(xì)胞胞質(zhì)嗜堿性較強(qiáng)，核大染色較深，核質(zhì)較少。此期一生只經(jīng)歷1次，在幼體多棘海盤車性腺發(fā)生時(shí)形成。

Ⅱ期：卵巢開始發(fā)育或產(chǎn)卵后重新發(fā)育。

該時(shí)期卵巢不透明，長(zhǎng)度一般為0.5～1.5cm，寬度為0.15～0.40cm。

組織學(xué)切片顯示卵巢外壁較厚，雙層結(jié)構(gòu)明顯。卵巢內(nèi)腔可能充滿無定形組織，也可能包含嗜伊紅細(xì)胞碎片和吞噬細(xì)胞。一些早期和中期的具有卵黃的卵母細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)，整個(gè)卵母細(xì)胞的外周有一薄層濾泡質(zhì)。生殖上皮出現(xiàn)褶皺，增加表面積以供大量卵子發(fā)生。初級(jí)卵母細(xì)胞一般不規(guī)則排列于卵巢內(nèi)生殖上皮附近，分布較散。形態(tài)不規(guī)則，有三角形、梨形、圓形或橢圓形等（見圖2b）。卵徑約為5.80～13.89μm，平均為（9.56±0.86）μm（見表1）。細(xì)胞質(zhì)顆粒均勻分布，被染成深紫色而顯示強(qiáng)嗜堿性。細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈圓形或橢圓形。此期卵巢成熟系數(shù)為0.31‰～14.94‰，平均為（2.91±0.57）‰。2～8月采集的多棘海盤車卵巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅲ期：卵巢正在成熟。

卵巢逐漸發(fā)育，末端逐漸膨大并出現(xiàn)分枝，長(zhǎng)度一般為1.5～2.5cm，寬度為0.40～0.60cm。

表1 不同時(shí)相卵母細(xì)胞的直徑Table 1 Oocyte diameter at different phases in Asterias amurensis ovaries

組織學(xué)切片顯示卵母細(xì)胞數(shù)目明顯增多（見圖2c），生發(fā)層內(nèi)出現(xiàn)不同時(shí)期的卵母細(xì)胞（見圖2e）。此時(shí)卵黃開始形成和積累。生殖上皮輪廓迂回，血細(xì)胞層充滿了褶皺的中心，形成血竇，呈明顯的嗜伊紅性。卵黃形成早期，卵母細(xì)胞形狀不規(guī)則，呈梨形或橢圓形，由卵柄與血細(xì)胞層緊密連接，卵徑約13.40～36.97μm，平均為（22.55±0.38）μm（見表1）。卵母細(xì)胞基部附于濾泡壁膜上，另一側(cè)則明顯突入濾泡腔。卵母細(xì)胞細(xì)胞膜清晰，核大，近球形（見圖2d）。卵黃形成中期卵徑約36.39～76.88μm，平均為（60.34±1.79）μm（見表1）。卵黃形成后期，卵母細(xì)胞因卵黃大量積累體積變得很大，形成成熟的卵細(xì)胞，卵徑約為62.41～128.24μm，平均卵徑為（91.36±5.36）μm（見表1）。卵母細(xì)胞大多呈圓球形，外周濾泡膜明顯，但形態(tài)不一，核大、核內(nèi)染色質(zhì)少。卵母細(xì)胞在濾泡內(nèi)成熟時(shí)，與卵柄脫離，逐漸向卵巢中央移動(dòng)。隨著成熟的卵母細(xì)胞數(shù)目增多，卵巢壁逐漸變薄，血細(xì)胞層也逐漸變得不明顯（見圖2e）。該期卵巢成熟系數(shù)為2.01‰～128.44‰，平均為（65.03±8.21）‰，8～10月采集的多棘海盤車卵巢多處于這個(gè)時(shí)期。

圖2 多棘海盤車不同發(fā)育時(shí)期卵巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Histological structure of ovaries in Asterias amurensis at different stages

Ⅳ期：性腺完全成熟，即將產(chǎn)卵。

卵巢已經(jīng)很發(fā)達(dá)，呈橙紅色，膨大飽滿且分枝較多，有的伸長(zhǎng)至腕末端。長(zhǎng)度一般長(zhǎng)于2.5cm，寬度寬于0.60cm。

切片顯示此期卵巢主要特點(diǎn)是卵巢中積聚大量成熟的卵細(xì)胞，呈橢圓形或圓球形，卵徑為67.74～142.77μm，平均卵徑為（98.05±0.70）μm（見表1）。核大、核徑約為7.31～10.64μm，平均為（8.65±0.25）μm（見表1）。卵母細(xì)胞已從濾泡膜中脫出，成游離狀態(tài)。生殖上皮周圍的初級(jí)卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，卵巢壁薄且光滑（見圖2f）。此期卵巢成熟系數(shù)97.17‰～257.07‰，平均（182.80±19.94）‰，10～11月上旬采集的多棘海盤車卵巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅴ期：已部分產(chǎn)卵的卵巢。

卵巢部分開始萎縮，顏色開始變暗，長(zhǎng)度一般為1.0～4.0cm，寬度為0.20～0.50cm。

組織切片顯示卵巢壁薄。由于成熟卵細(xì)胞的排放，剩余的成熟卵母細(xì)胞松散地排列于內(nèi)腔，留有很多空間（見圖2g）。在一些雌性個(gè)體產(chǎn)卵前期和中期，具卵黃的卵母細(xì)胞在生殖上皮繼續(xù)發(fā)育，生成的卵母細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)腔代替已經(jīng)排出的卵細(xì)胞。內(nèi)腔出現(xiàn)一些殘余的卵母細(xì)胞碎片和吞噬細(xì)胞。此期卵巢成熟系數(shù)為6.21‰～285.54‰，平均為（67.04±23.38）‰，11月下旬～12月上旬采集的多棘海盤車卵巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅵ期：產(chǎn)卵后的卵巢。

排完卵的卵巢萎縮、呈棕黃色，體積顯著縮小，只占體腔一小部分。長(zhǎng)度一般為1.0～2.5cm，寬度為0.15～0.30cm。

組織切片顯示卵巢壁增厚，雙層囊狀結(jié)構(gòu)明顯，血細(xì)胞層開始擴(kuò)展并逐漸增厚。內(nèi)腔含有少量未排出的卵細(xì)胞。這些殘余的卵細(xì)胞中卵黃被消化吸收，逐漸開始衰退。內(nèi)腔中出現(xiàn)大量的吞噬細(xì)胞和細(xì)胞殘?。ㄒ妶D2h）。此期卵巢成熟系數(shù)0.90‰～15.97‰，平均為（5.21±0.75）‰，12月中旬～1月采集的多棘海盤車卵巢多處于這個(gè)時(shí)期。

2.2 精巢

2.2.1 解剖學(xué)特征 多棘海盤車精巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)及組成與卵巢類似，無明顯區(qū)別，非生殖季節(jié)精巢細(xì)小，分枝少，很難依據(jù)顏色與形態(tài)辨別出雌雄。成熟精巢呈淡黃或乳白色，因充滿精液而膨大，輕輕擠壓會(huì)有乳白色漿體滲出。

2.2.2 精巢發(fā)育分期及對(duì)應(yīng)的形態(tài)特征 多棘海盤車精巢中生殖細(xì)胞的存在狀態(tài)也可以分為6個(gè)時(shí)相。根據(jù)精巢的外觀特征、組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和成熟系數(shù)等將精巢發(fā)育的周年變化分為6期。除成熟期可以通過外觀的淡黃或乳白色及解剖后有乳白色漿體滲出可以區(qū)分雌雄外，其他期的精巢都需要組織學(xué)方法來確定雌雄及精巢發(fā)育程度。組織學(xué)結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)是生殖上皮中生精細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)、內(nèi)腔中精細(xì)胞的數(shù)量、血細(xì)胞層的發(fā)展程度，隨著精巢的發(fā)育，嗜堿性逐漸增強(qiáng)。與卵巢一樣，精巢同樣具有海盤車科性腺典型的雙層囊狀結(jié)構(gòu)。精巢各期的主要特征如下：

Ⅰ期：精巢尚未發(fā)育。

精巢呈透明錐狀，長(zhǎng)度一般小于0.5cm，寬度小于0.15cm。

組織學(xué)切片顯示精巢中有許多精原細(xì)胞，胞質(zhì)嗜堿性較強(qiáng)，核大染色深。Ⅰ期精巢在幼體性腺發(fā)生時(shí)形成，一生只經(jīng)歷1次（見圖3a）。

圖3 多棘海盤車不同發(fā)育時(shí)期精巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Histological structure of testes in Asterias amurensis at different stages

Ⅱ期：精巢開始發(fā)育或排精后重新發(fā)育。

精巢半透明，長(zhǎng)度一般為0.5～1.5cm，寬度為0.15～0.35cm。包括初次進(jìn)入生殖周期的精巢以及繁殖后重新發(fā)育的精巢。

組織學(xué)切片顯示精巢壁增厚，位于生殖上皮的精母細(xì)胞嗜堿性強(qiáng)，呈縱隊(duì)狀排列。生殖上皮開始出現(xiàn)較多褶皺，表面積增加以供大量的精子發(fā)生。褶皺的中心形成血液竇，血細(xì)胞層向外擴(kuò)展，呈顯著的嗜伊紅性（見圖3b）。內(nèi)腔中可能存在殘存的精子。此期精巢成熟系數(shù)在0.21‰～22.69‰之間，平均為（3.01±0.89）‰，2～8月期間的多棘海盤車精巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅲ期：精巢正在成熟。

此期精巢逐漸發(fā)育，分枝增多。長(zhǎng)度一般1.5～2.5cm，寬度0.30～0.50cm。

組織學(xué)切片顯示精子發(fā)生劇烈，縱隊(duì)狀的精原細(xì)胞發(fā)育經(jīng)初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞后形成精子。初級(jí)精母細(xì)胞呈圓形，直徑小于精原細(xì)胞，細(xì)胞核染色深（見圖3f）。成熟的精子細(xì)胞呈圓形，無明顯的細(xì)胞質(zhì)，只含有嗜堿性強(qiáng)的細(xì)胞核，成熟后向內(nèi)腔擴(kuò)展延伸（見圖3d）。生殖上皮褶皺逐漸減少，血細(xì)胞層逐漸變得不明顯（見圖3c）。

Ⅳ期：精巢接近成熟。

此期精巢成熟系數(shù)為2.21‰～132.11‰，平均為（51.90±9.28）‰，8～10月采集的多棘海盤車精巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅳ期：精巢完全成熟，即將排精。

精巢飽滿，呈淡黃色或乳白色，輕輕擠壓表面會(huì)有少量乳白色漿液滲出，這是精巢成熟的標(biāo)志。長(zhǎng)度一般長(zhǎng)于2.50cm，寬度寬于0.50cm。

組織學(xué)切片顯示精巢壁薄且光滑，內(nèi)腔中充滿精子，精子大量聚集成渦流狀（見圖3e）。生殖上皮縱列的精原細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，因此盡管繁殖早期可能釋放了一部分精子，但精巢仍保留著成熟的外形，且精原細(xì)胞層逐漸變薄（見圖3g）。此期精巢成熟系數(shù)為117.12‰～375.74‰，平均為（189.33±26.86）‰，10～11月采集的多棘海盤車精巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅴ期：部分排精的精巢。

精巢部分開始萎縮，排精后的精巢呈棕黃色，長(zhǎng)度一般為1.0～4.0cm，寬度為0.20～0.45cm。

組織切片顯示內(nèi)腔中精子排列稀疏，生殖上皮精原細(xì)胞與中央精子團(tuán)之間會(huì)出現(xiàn)間隙（見圖3h）。繁殖后期，生殖上皮的精原細(xì)胞減少，此期精巢成熟系數(shù)19.82‰～290.00‰，平均為（136.00±22.71）‰，11月～12月中旬采集的多棘海盤車精巢多處于這個(gè)時(shí)期。

Ⅵ期：排精后的精巢。

排精后的精巢萎縮、呈棕黃色，體積縮小，只占體腔一小部分。長(zhǎng)度一般為1.0～2.5cm，寬度為0.15～0.30cm。

組織切片顯示精巢壁增厚，雙層囊狀結(jié)構(gòu)明顯，血細(xì)胞層開始擴(kuò)展并逐漸增厚。內(nèi)腔存在少量未排出的精子，出現(xiàn)吞噬細(xì)胞（見圖3i）。生殖上皮僅有少量精原細(xì)胞存在。此期精巢成熟系數(shù)1.35‰～32.19‰，平均為（6.03±1.21）‰，12月下旬至次年1月采集的多棘海盤車精巢多處于這個(gè)時(shí)期。

2.3 性腺發(fā)育的月變化

卵巢在2～5月多處于Ⅵ期產(chǎn)卵后的階段，卵巢中殘留的卵母細(xì)胞和空濾泡逐漸退化并被消化吸收。6～7月多處于Ⅱ期，8～9月起卵巢開始進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育階段，Ⅲ期個(gè)體逐漸增多，卵巢迅速由Ⅲ期進(jìn)入成熟Ⅳ期。10～11月出現(xiàn)發(fā)育成熟并開始排卵的Ⅴ期個(gè)體，12月部分排卵的Ⅴ期個(gè)體數(shù)達(dá)到最大，隨著繁殖的進(jìn)行，產(chǎn)卵后Ⅵ期個(gè)體增多，次年2月份達(dá)到最大。說明多棘海盤車雌性繁殖高峰期主要集中在10月至次年1月（見圖4A）。

精巢在8月開始生長(zhǎng)發(fā)育，9月Ⅲ期個(gè)體數(shù)增多，并迅速由Ⅲ期進(jìn)入成熟Ⅳ期。10月即出現(xiàn)部分排精個(gè)體，11月部分排精的Ⅴ期個(gè)體數(shù)達(dá)到最大，隨著繁殖的進(jìn)行，排完精的Ⅵ期個(gè)體從12月開始出現(xiàn)，并一直持續(xù)至次年2月。說明多棘海盤車雄性繁殖高峰期主要集中在10～12月（見圖4B）。

圖4 雌性個(gè)體卵巢和雄性個(gè)體精巢發(fā)育的月變化Fig.4 Monthly variation of gonadal development in Asterias amurensis based on the relative frequencies of ovary and testis phrases

2.4 性成熟系數(shù)和消化腺指數(shù)的周年變化

多棘海盤車雌性在8～9月開始生長(zhǎng)發(fā)育，10月卵巢迅速生長(zhǎng)，成熟系數(shù)迅速增加，達(dá)到最大（＝69.87，SE＝14.13；n＝23），11月略有下降（＝68.28，SE＝16.07；n＝29）。成熟系數(shù)在12月至次年1月急劇下降，2月之后保持較平穩(wěn)的狀態(tài)。精巢的成熟系數(shù)變化情況與卵巢類似，在10月達(dá)到最大（＝74.44，SE＝12.53；n＝27），11月略有下降（＝73.27，SE＝18.19；n＝31），12月至次年1月急劇下降，2月之后大多進(jìn)入恢復(fù)狀態(tài)，成熟系數(shù)略有增加。

雌性和雄性個(gè)體消化腺指數(shù)有比較明顯的周期性特征（見圖5）。消化腺指數(shù)在周年內(nèi)呈現(xiàn)雙峰變化，7月達(dá)到一個(gè)峰值，隨著性腺開始發(fā)育而逐漸減小，雌性個(gè)體在10月達(dá)到最低（＝11.31，SE＝0.69；n＝23）（見圖5），雄性個(gè)體在11月達(dá)到最低（＝9.73，SE＝0.60；n＝31）（見圖5）。性成熟個(gè)體繁殖過后，消化腺指數(shù)開始逐漸增大。

圖5 多棘海盤車雌性個(gè)體和雄性個(gè)體性成熟系數(shù)和消化腺指數(shù)的月變化Fig.5 Variation of gonad（GI）and pyloric caecal index（PI）between females and males of Asterias amurensis at different months

2.5 性別比例

統(tǒng)計(jì)2010年6月～2012年5月可明顯辨別雌雄的樣本共281個(gè)，其中雌性144只，雄性137只（見表2），整體雌雄比約為1.05∶1。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示與雌雄比1∶1之間無顯著差異。

表2 各月雌雄個(gè)體數(shù)Table 2 Numbers of females and males in different months

3 討論

3.1 性腺發(fā)育分期

多棘海盤車的性腺結(jié)構(gòu)是海盤車科種類的典型結(jié)構(gòu)［17］。繁殖后生殖上皮輪廓曲折，血細(xì)胞層在配子形成前以及配子形成過程中循環(huán)存在。當(dāng)配子發(fā)育時(shí)，血細(xì)胞層逐漸變薄，配子排放之后血細(xì)胞層增厚，這種特征也是海盤車屬種類的典型特征［18－20］。

多棘海盤車性腺發(fā)育目前有多種分期方法，Byrne根據(jù)卵母細(xì)胞細(xì)胞核直徑大小、卵母細(xì)胞內(nèi)容物的沉積變化和形態(tài)特征等將性腺發(fā)育分為恢復(fù)期、生長(zhǎng)期、成熟期、部分產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵后期5期［3］，Vevers將海星卵巢發(fā)育分為休止期、未成熟期、生長(zhǎng)期、完全成熟期、排放后期和恢復(fù)期6期［16］，Kim將多棘海盤車的性腺周年發(fā)育共分為7期［13］。Giese和Pearse，Byrne認(rèn)為性成熟系數(shù)法與組織學(xué)方法結(jié)合起來確定生物繁殖規(guī)律有較高的準(zhǔn)確性［21］。本文依據(jù)性成熟系數(shù)及性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，主要參照 Vevers［16］和 Byrne［3］的分期方法，將多棘海盤車的性腺發(fā)育共分為6期。其中卵巢組織學(xué)特征主要根據(jù)卵巢組織學(xué)切片上面積比例超過50%或比例相對(duì)較高的卵母細(xì)胞的時(shí)相確定，具體通過卵母細(xì)胞的卵徑、核徑、核仁數(shù)目等參數(shù)指標(biāo)以及液泡、卵黃粒、濾泡膜等形態(tài)特征來確定卵母細(xì)胞的形態(tài)發(fā)育特征。精巢分期的組織學(xué)結(jié)構(gòu)主要依據(jù)生殖上皮中的生精細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)、內(nèi)腔中精細(xì)胞的數(shù)量、血細(xì)胞層的發(fā)展程度等特點(diǎn)來確定。

3.2 繁殖規(guī)律

多棘海盤車為雌雄異體，雌雄個(gè)體大小、外觀無明顯差異，性比接近1∶1，這與棘皮動(dòng)物門其他雌雄異體的動(dòng)物一致［22］。Fuji采集了不同海區(qū)的蝦夷馬糞海膽（Strongylocentrotusintermedius）樣本，并統(tǒng)計(jì)雌雄比例，得出性比約為1∶1［23］。Kim對(duì)日本陸奧灣［13］的多棘海盤車樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均得出性比為1∶1的結(jié)論。本研究中青島浮山灣多棘海盤車整體雌雄比約為1.05∶1，推測(cè)是由于采集數(shù)量不足所致，可以認(rèn)為雌雄性別比例接近1∶1。

不同種類的卵巢內(nèi)卵子發(fā)育狀況差異反映出不同的產(chǎn)卵規(guī)律，因此形成了不同的產(chǎn)卵類型。產(chǎn)卵類型決定著資源補(bǔ)充的性質(zhì)，因此與種群數(shù)量波動(dòng)形式有密切關(guān)系［24］。以往對(duì)海星的研究發(fā)現(xiàn)海星卵巢主要是分批產(chǎn)卵型。Byrne研究發(fā)現(xiàn)八腕海星（Patiriellacalcar）和小面包海星（P.exigua）2種海星卵徑分布頻率為雙峰型，即分2批進(jìn)行產(chǎn)卵［21］。Marion等研究發(fā)現(xiàn)皇家海星（Astropectenarticulatus）雌性個(gè)體產(chǎn)卵時(shí)間持續(xù)較長(zhǎng)，卵巢可以長(zhǎng)時(shí)間處于發(fā)育的狀態(tài)［25］。Carvalho和Ventura通過對(duì)巴西東南部海域海燕（Asterinastellifer）2個(gè)群體的繁殖研究發(fā)現(xiàn)，不同群體的海燕繁殖規(guī)律類似，產(chǎn)卵期較長(zhǎng)而且不同步［26］。本研究的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在繁殖期間隨著排卵的進(jìn)行，多棘海盤車卵巢壁附近仍然持續(xù)產(chǎn)生初級(jí)卵母細(xì)胞，隨著成熟卵細(xì)胞的排出，初級(jí)卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育成成熟的卵細(xì)胞并排出。因此多棘海盤車雌性個(gè)體并不是一次性將卵排出，屬于多次產(chǎn)卵型。

3.3 繁殖期與環(huán)境因素的關(guān)系

通常海星的配子形成過程有明顯的季節(jié)性［27］。季節(jié)性變化的環(huán)境因素，如海水溫度、日照長(zhǎng)度及食物的供應(yīng)情況等，可以影響海星的有性生殖過程［28］。其中水溫和食物供應(yīng)是影響海星繁殖發(fā)育最主要的2個(gè)因素［29］。

本研究結(jié)合性成熟系數(shù)法與組織學(xué)方法發(fā)現(xiàn)多棘海盤車有明顯的繁殖周期。一般來說，北半球海盤車科的種類在秋季和冬季配子開始快速發(fā)育，春天進(jìn)行繁殖［30］。日本沿海多棘海盤車（35°N～41°N）在冬季1月份性腺發(fā)育最好，冬末或早春（2～5月）當(dāng)溫度為5～12 ℃時(shí)開始產(chǎn)卵［13－14］。澳大利亞德文特河河口（42°S）的多棘海盤車性腺發(fā)育規(guī)律與日本沿海的種類相類似，卵巢在秋、冬季開始發(fā)育，春季（7～10月）當(dāng)?shù)讓铀疁剡_(dá)到10～13℃開始產(chǎn)卵［3］。Novikova研究發(fā)現(xiàn)俄羅斯彼得大帝灣的多棘海盤車一年繁殖2次，分別在夏季和秋季（6、9月），表層水溫為17和23℃時(shí)產(chǎn)卵［12］（見表3）。本調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青島濱海水溫在8月份達(dá)到最高（http：//ocean.qingdao.gov.cn），并開始逐月下降，而多棘海盤車在8～9月份性腺開始快速發(fā)育。本研究海域多棘海盤車繁殖期集中在10月至次年1月，11～12月為繁殖盛期，此時(shí)水溫平均為9.6～16.2℃。Pearse和Eernisse研究發(fā)現(xiàn)赭石海星（Pisasterochraceus）在4月份溫度最高時(shí)開始發(fā)育，在7月溫度較低時(shí)開始繁殖，因此，可以認(rèn)為水溫是影響海星配子發(fā)育的重要因素之一［31］。

表3 北半球和南半球多棘海盤車繁殖季節(jié)的比較Table 3 Comparison of spawning season between northern and southern populations of Asterias amurensis

Pearse和Eernisse研究認(rèn)為光照周期及強(qiáng)度刺激赭石海星的性腺生長(zhǎng)，短日照刺激性腺生長(zhǎng)，而長(zhǎng)日照可以使得性腺生長(zhǎng)受到抑制［30］。這種繁殖受光照影響的模式在其他海星的研究中也有報(bào)道，主要包括Sclerasteriasmollis［32］，Coscinasteriastenuispina［33］。 本 實(shí)驗(yàn)中日照長(zhǎng)度自6月開始逐漸縮短，在12月達(dá)到最低（http：//sunrise.supfree.net），此時(shí)多棘海盤車處于繁殖期。Eckelbarger認(rèn)為光照主要影響卵子中卵黃的發(fā)育速度，由多棘海盤車繁殖周期較短的特點(diǎn)可以認(rèn)為其卵黃形成速度較快，繁殖率高［34］。日照長(zhǎng)度和周期也影響海水中浮游植物的生長(zhǎng)，秋季和初冬季節(jié)浮游植物生長(zhǎng)旺盛可為海星浮游幼蟲的生長(zhǎng)提供食物來源［35］。Pearse和Walker認(rèn)為在許多海星的繁殖活動(dòng)中，海水溫度和日照長(zhǎng)度及周期對(duì)海星配子發(fā)育起到復(fù)雜的協(xié)同作用［30］。

3.4 GI與PI關(guān)系

多棘海盤車在8～9月開始發(fā)育，GI在9月份急劇上升，繁殖季節(jié)由于部分配子的釋放，GI會(huì)同步下降，10月份GI達(dá)到最大，11月份略有下降，分析原因可能是由于多棘海盤車繁殖早期伴隨著部分配子的釋放，性腺繼續(xù)發(fā)育，新形成的配子代替釋放的配子，較高的GI意味著配子補(bǔ)充較多、環(huán)境營(yíng)養(yǎng)條件較好［3］。隨著配子的大量釋放，GI急劇下降。在1～2月性腺處于排放后的恢復(fù)期，GI較平穩(wěn)，直到下一次生殖開始。

海星的儲(chǔ)能器官是消化腺［22，36］。充足的食物供應(yīng)使海星消化腺重量增加，為性腺發(fā)育儲(chǔ)備能量［27］。由于海星的繁殖期較短，因此需要花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間來儲(chǔ)備能量以備繁殖時(shí)的高能量消耗［37－38］。在整個(gè)生殖循環(huán)中，PI和 GI之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系比較常見［21，28，32，39］。本試驗(yàn)中多棘海盤車PI在7月達(dá)到最大，隨著8月性腺開始發(fā)育PI逐漸降低，而10～11月時(shí)開始逐漸升高，說明在性腺發(fā)育期間消化腺為性腺發(fā)育提供了能量，在繁殖結(jié)束后開始儲(chǔ)備能量以備下一次生殖周期利用。

綜上所述，青島浮山灣地區(qū)與日本、澳大利亞沿海的多棘海盤車有類似的繁殖規(guī)律，雌雄異體，性比1∶1，均在水溫開始下降的秋、冬季節(jié)開始繁殖，冬末或早春開始幼體發(fā)育。海水溫度及日照長(zhǎng)短會(huì)影響性腺發(fā)育。在不同的發(fā)育時(shí)期，性腺含有不同時(shí)相的卵母細(xì)胞、精母細(xì)胞。整體來看，性腺生長(zhǎng)期間，消化腺為其提供能量，性成熟系數(shù)和消化腺指數(shù)在一周年內(nèi)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

［1］楊德漸，孫世春.海洋無脊椎動(dòng)物學(xué)［M］.青島：青島海洋大學(xué)出版社，1999：486-496.

［2］O＇Hara T.Northern Pacific seastar［J］.Vic Nat，1995，112：261.

［3］Byrne M，Morrice M G，Wolf B.Introduction of the northern Pacific asteroidAsteriasamurensisto Tasmania：reproduction and current distribution［J］.Mar Bio，1997，127（4）：673-685.

［4］Minchin D.Decapod predation and the sowing of the scallop，Pectenmaximus（Linnaeus，1758）［C］.//Shumway S E，Sandifer P A.An International Compendium of Scallop Biology and Culture.Baton Rouge：World Aquaculture Society，1991.

［5］Spencer B E.Predators and methods of control in molluscan shelfish cultivation in North European waters［J］.EAS Special Publication，1992，16：309-338.

［6］Nakachi M，Moriyama H，Hoshi M，et al.Acrosome reaction is subfamily specific in sea star fertilization［J］.Dev Biol，2006，298（2）：597-604.

［7］Matsumoto M，Solzin J，Helbig A，et al.A sperm-activating peptide controls a cGMP-signaling pathway in starfish sperm［J］.Dev Biol，2003，260（2）：314-324.

［8］Nishigaki T，Chiba K，Hoshi M.A 130-kDa membrane protein of sperm flagella is the receptor for asterosaps，sperm-activating peptides of starfishAsteriasamurensis［J］.Dev Biol，2000，219（1）：154-162.

［9］Lee C H，Ryu T K，Choi J W.Effects of water temperature on embryonic development in the northern Pacific asteroid，Asterias amurensis，from the southern coast of Korea［J］.Invertebr Reprod Dev，2004，45（2）：109-116.

［10］Lee C H，Ryu T K，Chang M，et al.Effect of silver，cadmium，chromium，copper，and zinc on the fertilization of the Northern Pacific asteroid，Asteriasamurensis［J］.B Environ Contam Tox，2004，73（4）：613-619.

［11］Lamash N E.Identification and isolation of GTP-binding regulatory protein from starfish（Asteriasamurensis）oocyte plasma membranes［J］.Biol Bull，2001，28（1）：107-109.

［12］Novikova G P.Reproductive cycles of sea starsAsteriasamurensisandPatiriapectiniferain Peter the Great Bay，sea of Japan［J］.Biol Morya Kiev，1979，6：33-40.

［13］Kim Y S.Histological observations of the annual change in the gonad of the starfish，AsteriasamurensisLüken［J］.Bull Fac Fish Hokkaido Univ，1968，19（2）：97-108.

［14］Hatanaka M，Kosaka M.Biological studies on the population of the starfish，Asteriasamurensis，in Sendai Bay［J］.Tohoku J Agric Res，1959，9（3）：159-178.

［15］胡泗才，王立屏.動(dòng)物生物學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：96.

［16］Vevers H G.The biology ofAsteriasRubensL.：growth and reproduction［J］.J Mar Biol Assoc UK，1949，28（1）：165-187.

［17］Walker C W.Nutrition of gametes［C］.//Jangoux M.Echinoderm nutrition.Rotterdam：Balkema，1982.

［18］Schoenmakers H J N，Colenbrander P H J M，Peute J，et al.A-natomy of the ovaries of the starfishAsteriasrubens（Echinodermata）［J］.Cell Tissue Res，1981，217（3）：577-597.

［19］Kasyanov V L.Reproductive strategies of sea stars from the Sea of Japan［C］.Rotterdam：Balkema，1988.

［20］Beijnink F B，Walker C W，Voogt P A.An ultrastructural study of relationships between the ovarian haemal system，follicle cells，and primary oocytes in the sea star，Asteriasrubens［J］.Cell Tissue Res，l984，238（2）：339-347.

［21］Byrne M.Reproduction of sympatric population ofPatiriellagunii，P.calcarandP.exiguain New South Wales，asterinid seastars with direct development［J］.Mar Biol，1992，114：297-316.

［22］Lawrence J M.A functional biology of echinoderms［M］.London：Croom Helm，1987：17-96.

［23］Fuji A.Studies on the biology of the sea urchin：II.Size at first maturity and sexuality of two sea urchins，StrongylocentrotusnudusandS.intermedius［J］.Bull Fac Fish Hokkaido Univ，1960，11（2）：43-48.

［24］陳大剛.漁業(yè)資源生物學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997：72.

［25］Marion K R，Watts S A，McClintock J B，et al.Seasonal gonad maturation inAstropectenarticulatusfrom the Northern Gulf of Mexico［C］.// Mooi R.Echinoderms.Rotterdam：Balkema，1998.

［26］Carvalho A L P S，Ventura C R R.The reproductive cycle ofAsterinastellifera（Mbius）（Echinodermata：Asteroidea）in the Cabo Frio region，southeastern Brazil［J］.Mar Biol，2002，141：947-954.

［27］Chia F S，Walker C W.Echinodermata：Asteroidea［J］.Reproduction of marine invertebrates，1991，6：301-353.

［28］Lawrence J M.Level，content and caloric equivalents of the lipid，carbohydrate and protein in the body components ofLuidiaclathrata（echinodermata：asteroidean：platyasterida）in Tampa bay［J］.J Exp Mar Biol Ecol，1973，11（3）：263-274.

［29］Lawrence J M，Ellwood A.Simultaneous allocation of resources to arm regeneration and to somatic and gonadal production inLuidiaclathrata（Say） Echinodermata： Asteroidea）［C］.//Yanagisawa T.Biology of Echinodermata.Rotterdam：Balkema，1991.

［30］Pearse J S，Walker C W.Photoperiodic regulation of gametogenesis in a North Atlantic sea star，Asteriasvulgaris［J］.Int J Invertebr Reprod Dev，1986，9（1）：71-77.

［31］Pearse J S，Eernisse D J.Photoperiodic regulation of gametogenesis and gonadal growth in the sea starPisasterochraceus［J］.Mar Biol，1982，67（2）：121-125.

［32］Barker M，Xu R A.Population differences in gonad and pyloric caeca cycles of the New Zealand seastarSclerasteriasmollis（E-chinodermata：Asteroidea）［J］.Mar Biol，1991，108（1）：97-103.

［33］Alves S L S，Pereira A D，Ventura C R R.Sexual and asexual reproduction ofCoscinasteriastenuispina（Echinodermata：Aster-oidea）from Rio de Janeiro，Brazil［J］.Mar Biol，2002，140（2）：95-101.

［34］Eckelbarger K J.Ultrastructural features of gonads and gametes in deep-sea invertebrates［C］.//Young C M，Eckelbarger K J.Reproduction，larval biology，and recruitment of the deep-sea benthos.New York：Col Univ Pre，1994.

［35］Catalina T，Ward P，Rubilar T，et al.Reproductive biology ofCosmasteriaslurida（Echinodermata：Asteroidea）an anthropogenically influenced substratum from Golfo Nuevo，Northern Patagonia（Argentina）［J］.Mar Biol，2007，151（1）：205-217.

［36］Jangoux M，van Impe E.The annual pyloric cycle ofAsteriasrubensL.（Echinodermata：Asteroidea）［J］.J Exp Mar Biol Eco，1977，30（2）：165-184.

［37］Ferguson J C.Fatty acid and carbohydrate storage in the annual reproductive cycle ofEchinaster［J］.Comp Biochem Phys，1975，52（4）：585-590.

［38］Crump R G.Annual reproductive cycles in three geographically separated populations ofPatiriellaregularis（Verrill），a common New Zeland asteroid［J］.J Exp Mar Biol Ecol，1971，7（4）：137-162.

［39］Rubilar T，Ward P C T，Vivar D M E.Sexual and asexual reproduction ofAllostichastercapensis（Echinodermata：Asteroidea）in Golfo Nuevo［J］.Mar Biol，2005，146（6）：1083-1090.