仿刺參養(yǎng)殖區(qū)泥樣中燦爛弧菌拮抗菌的快速篩選及其保護(hù)作用*

陳四清，李 杰，韓 茵，唐 磊，白海盟，劉長琳，鄒安革，祁自忠

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.山東安源水產(chǎn)股份有限公司，山東 煙臺 265600）

仿刺參（Apostichopusjaponicus）養(yǎng)殖以其單種類產(chǎn)值最高和每年20%的增長速度，成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要支柱之一。2011年度山東省仿刺參的養(yǎng)殖面積達(dá)5.3萬hm2，年產(chǎn)量7.1萬t（超過全國總產(chǎn)量一半），年產(chǎn)值達(dá)160億元［1］。然而，近年來隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種病害接踵而至，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展［2］。

仿刺參保苗期和養(yǎng)成期發(fā)生的“腐皮綜合征”波及面廣、傳染性強(qiáng)、死亡率極高，給仿刺參養(yǎng)殖造成了慘重的經(jīng)濟(jì)損失［4］。其癥狀主要表現(xiàn)為厭食、搖頭、腫嘴、排臟、身體萎縮、口部潰爛乃至體表大面積潰瘍；每年的1～4月養(yǎng)殖水體溫度較低時(shí)（＜8℃）是發(fā)病高峰期，這種病在育苗場多發(fā)生在2、3月，池塘養(yǎng)殖則多發(fā)生在3、4月，其高感染率通常引起成參50%的死亡率和稚參的全部死亡，屬于急性死亡［3］。而燦爛弧菌（Vibriosplendidus）是引起養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合征”的主要病原菌之一，其致病力強(qiáng)，既能引起仿刺參表皮潰瘍，也能誘發(fā)幼參爛胃病［5－6］。燦爛弧菌也是海水魚類的重要致病菌之一，可引發(fā)大菱鲆（Scophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthysolivaceus）、大西洋鮭（Salmosalar）、鱒魚（Squaliobarbusourriculus）、鱸魚（Lateolabraxjaponicus）等患多種疾病。病魚明顯特征為尾部有出血點(diǎn)，皮膚腐爛，嚴(yán)重的形成潰瘍；背鰭、胸鰭、尾鰭的鰭條基部充血；肝臟腫大、糜爛；腎臟糜爛等癥狀［7］。

為了控制仿刺參病害的發(fā)生，許多養(yǎng)殖戶選擇大量使用抗生素，而長期使用抗生素會導(dǎo)致藥物的殘留、養(yǎng)殖環(huán)境惡化、病原耐藥性增強(qiáng)等負(fù)面影響。而且，由于仿刺參病害病因的復(fù)雜性，病原的多樣性、區(qū)域性和不確定性，給養(yǎng)殖生產(chǎn)中的防治增加了難度，且易造成生產(chǎn)中藥物的濫用［8］。近些年來，抗生素已經(jīng)陸續(xù)被許多國家明令禁止作為飼料添加劑來使用，并嚴(yán)禁直接向養(yǎng)殖水域中潑灑抗生素［6］。人們開始努力尋求抗生素的有效替代方法，如水產(chǎn)疫苗的開發(fā)、免疫增強(qiáng)劑的研究和水產(chǎn)益生菌的應(yīng)用。在此過程中，益生菌以其能夠抑制病原微生物，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力，促進(jìn)生長、無污染和毒副作用等優(yōu)良的功效而逐漸被人們所重視，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到越來越多的關(guān)注。芽孢桿菌（Bacillustoyoi）是第一類應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌，有效地降低由于愛德華氏菌侵染引起的日本鰻鱺（Anguillajaponica）鰻苗的死亡［9］。此后益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用得到了迅速發(fā)展。如今國內(nèi)外成功研制并常用的有益菌種包括光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌等［10］。而目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用的芽孢桿菌菌種有枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、巨大芽孢桿菌（B.megeterium）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等［11］。

在本研究中，采用不同的培養(yǎng)基和泥樣加熱的方法對青島市紅島仿刺參養(yǎng)殖區(qū)泥樣中的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離純化及16SrRNA基因序列分析。在通過菌種的安全性、抑菌活性和毒性測試后，用于仿刺參幼參的燦爛弧菌拮抗實(shí)驗(yàn)，并篩選出對燦爛弧菌有顯著拮抗作用的潛在有益菌，在仿刺參養(yǎng)殖中將有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)仿刺參幼參來源與馴化

實(shí)驗(yàn)用健康幼參購自山東蓬萊，平均體長為（4.00±0.78）cm，平均體質(zhì)量（0.95±0.07）g。將實(shí)驗(yàn)用健康幼參在水溫18～20℃的條件下馴化3d后開始試驗(yàn)，馴化期間不投喂任何飼料。

1.2 泥樣中可培養(yǎng)細(xì)菌分離純化及16SrRNA基因序列分析

2012年2 月，從紅島仿刺參養(yǎng)殖區(qū)無菌采集表層5cm的底泥，用10倍體積的無菌海水對底泥進(jìn)行稀釋混勻后置于50mL離心管中，設(shè)置2組平行。一管直接靜置15min取上清，另一管置于80℃水浴20min，再靜置15min后取上清。分別將2管上清液配制成0、10－1、10－2、10－34個(gè)不同的稀釋濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組；并各取100μL涂布于2216E及TCBS瓊脂平板；于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

根據(jù)菌落形態(tài)（菌落的大小、顏色、透明度、邊緣是否規(guī)則、濕潤或干燥、菌落突起、凹陷或平坦等）特征挑取不同菌落，分別在2216E及TCBS瓊脂平板上進(jìn)一步劃線純化，純化后的菌株保存至－80℃的超低溫冰箱。

采用酚－氯仿法［12］提取純化的菌株基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電泳條件為100V，30min）。再用細(xì)菌16SrDNA通用引物B8F-B1510（由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成）擴(kuò)增16SrRNA基因序列，上游引物 B8F序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物 B1510序列為：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并在253nm波長下觀察。用DNA膠回收試劑盒（購自北京博邁德生物科技有限公司）純化PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進(jìn)行同源序列比對。

1.3 泥樣中燦爛弧菌LJ08的人工感染實(shí)驗(yàn)

將分離鑒定的燦爛弧菌LJ08接種于2216E平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水將細(xì)菌從平板上洗下，制成1010CFU/mL的菌懸液。人工感染試驗(yàn)于預(yù)先消毒的盛有1.5L砂濾海水的玻璃燒杯中進(jìn)行。挑選32頭個(gè)體大小相當(dāng)?shù)慕】涤讌?，?頭一組，分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，每組2個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)組的感染濃度為107CFU/mL，空白對照組不加菌。整個(gè)試驗(yàn)期間不投喂任何飼料，水溫保持在18～20℃，充氣培養(yǎng)。及時(shí)清理排出的內(nèi)臟，每隔3d，徹底換水1次，補(bǔ)加菌懸液1次，保持107CFU/mL的感染濃度，連續(xù)3周，觀察發(fā)病、排臟和死亡情況。

1.4 海泥可培養(yǎng)細(xì)菌的安全性、抑菌活性和毒性的檢測

挑選17株分離純化的可培養(yǎng)細(xì)菌分別接種至綿羊血瓊脂平板［13］（購自青島奕維生物科技有限公司）上；置于28℃恒溫培養(yǎng)18～24h后觀察菌落形態(tài)及溶血情況。以大腸桿菌JM109（Escherichiacoli）為陰性對照。

選擇無溶血性的可培養(yǎng)細(xì)菌分別與前期分離獲得的燦爛弧菌LJ08在2216E平板上進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察抑菌情況。

選擇對燦爛弧菌LJ08有明顯抑菌作用的細(xì)菌分別接種于2216E平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水將細(xì)菌從平板上洗下，制成1010CFU/mL的菌懸液。毒性試驗(yàn)于預(yù)先消毒的盛有1.5L砂濾海水的玻璃燒杯中進(jìn)行。挑選個(gè)體大小相當(dāng)?shù)慕】涤讌⒂糜谠囼?yàn)，每6頭1組，每株菌為1組設(shè)3個(gè)平行。以107CFU/mL的浸泡濃度，對仿刺參進(jìn)行毒性試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)期間不投喂任何飼料，水溫保持在18～20℃，充氣培養(yǎng)。每隔3d，徹底換水1次，補(bǔ)加菌懸液1次，保持107CFU/mL的浸泡濃度，連續(xù)2周，觀察仿刺參排臟情況。

1.5 潛在有益菌對燦爛弧菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

海泥中3株可培養(yǎng)細(xì)菌通過菌種的安全性、毒性和抑菌效果測試后用于仿刺參幼參的燦爛弧菌拮抗實(shí)驗(yàn)。分別將這3株細(xì)菌和泥樣中分離獲得的燦爛弧菌LJ08接種于2216E平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水將細(xì)菌從平板上洗下，制成1010CFU/mL的菌懸液。

挑選個(gè)體大小相當(dāng)?shù)慕】涤讌B(yǎng)殖于預(yù)先消毒的盛有2L砂濾海水的玻璃燒杯中，每12頭1組。其中空白對照組未做任何處理，陽性對照組僅添加濃度為1010CFU/mL的燦爛弧菌菌懸液2mL。設(shè)計(jì)3組拮抗組，每組分別添加濃度為1010CFU/mL的一株海泥可培養(yǎng)細(xì)菌和燦爛弧菌菌懸液各2mL。每組設(shè)3個(gè)平行。整個(gè)試驗(yàn)期間不投喂任何飼料，水溫保持在18～20℃，充氣培養(yǎng)。每隔3d，徹底換水1次，補(bǔ)加菌懸液1次，保持原有的浸泡濃度。連續(xù)觀察2周，統(tǒng)計(jì)幼參排臟率，并計(jì)算保護(hù)率（%）＝｛（陽性對照組平均排臟率－試驗(yàn)組平均排臟率）/陽性對照組平均排臟率｝×100%。在拮抗實(shí)驗(yàn)的第12d，取1mL各實(shí)驗(yàn)組換水前的幼參養(yǎng)殖海水進(jìn)行系列稀釋，定量涂布TCBS瓊脂平板檢測實(shí)驗(yàn)水體中燦爛弧菌數(shù)量的變化。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.6 潛在有益菌LJ06的主要生理、生化特征鑒定

采用海洋細(xì)菌2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株LJ06。菌株的形態(tài)、主要生理和生化反應(yīng)指標(biāo)參照Xu［24］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 泥樣中可培養(yǎng)細(xì)菌分離純化及16SrRNA基因序列分析

從紅島仿刺參養(yǎng)殖區(qū)表層5cm的新鮮海泥中共分離獲得27株可培養(yǎng)細(xì)菌（見表1）。其中通過2216E培養(yǎng)基從未經(jīng)加熱處理的上清液中共分離獲得14株（LJ01-LJ09，LJ23，LJ25，LJ26，LJ31，LJ35）。除 了LJ04、LJ23、LJ25和LJ26屬于厚壁菌門（Firmicutes），其余10株分布在變形菌門（Proteobacteria），其中包括燦爛弧菌LJ08。通過TCBS培養(yǎng)基從未經(jīng)加熱處理的上清液中共分離獲得3株，均屬于變形菌門，分別為LJ43（燦爛弧菌），LJ-8（食環(huán)芳烴弧菌），LJ42（科爾韋爾氏希瓦氏菌）。通過2216E培養(yǎng)基從80℃加熱處理后的上清液中分離獲得10株可培養(yǎng)細(xì)菌（LJ10，LJ12，LJ27，LJ29，LJ30，LJ32-34，LJ39，LJ40），均分布在厚壁菌門；通過TCBS培養(yǎng)基從80℃加熱處理后的上清液中未分離獲得菌株。

在未經(jīng)加熱處理的海泥上清液中，變形菌門的細(xì)菌占總菌數(shù)的71.4%，均屬于γ－變形菌綱；而厚壁菌門占28.6%。加熱處理后，從海泥上清液中分離獲得的10株可培養(yǎng)細(xì)菌，7株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），只有LJ40屬類芽孢桿菌屬和LJ29、LJ30屬動(dòng)性球菌屬。

表1 紅島仿刺參養(yǎng)殖區(qū)泥樣中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及16SrRNA基因序列分析Table 1 Identification of the culturable predominant bacteria isolated from sea cucmber area in Hongdao by 16SrRNA gene sequencing

續(xù)表1

2.2 泥樣中燦爛弧菌LJ08的人工感染實(shí)驗(yàn)

浸泡感染實(shí)驗(yàn)第2天，仿刺參開始排臟，同時(shí)陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為身體萎縮、體表潰爛、口圍腫脹并出現(xiàn)潰爛白斑、管足松弛失去附著力而脫落至杯底，最后死亡。連續(xù)3周浸泡感染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組的排臟率達(dá)（56.25±6.12）%，死亡率為（43.75±6.33）%，對照組無一例死亡。無菌取人工感染后發(fā)病的仿刺參病灶組織涂布于TCBS平板，均可分離到大量菌落形態(tài)高度一致的細(xì)菌，其菌落形態(tài)、大小均與LJ08菌株相同。16SrDNA測序分析與LJ08菌株一致。

2.3 海泥可培養(yǎng)細(xì)菌的安全性、抑菌活性和毒性的檢測

通過加熱處理的方法從仿刺參養(yǎng)殖區(qū)海泥中分離到的多為芽孢桿菌。挑選17株分離純化的可培養(yǎng)細(xì)菌經(jīng)綿羊血瓊脂平板溶血性的檢測，發(fā)現(xiàn)LJ25、LJ30、LJ33和LJ34具有明顯的β型溶血性，除LJ30其余3株均屬于芽孢桿菌屬（見表2）。

選擇9株無溶血性的可培養(yǎng)細(xì)菌（LJ04、LJ06、LJ09、LJ23、LJ26、LJ29、LJ31、LJ35和LJ40）以及不能在綿羊血瓊脂平板生長的LJ01、LJ03、LJ05和LJ32，分別與前期分離獲得的燦爛弧菌LJ08采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，共篩選出3株對燦爛弧菌有抑菌圈的細(xì)菌，分別為LJ03，LJ04和LJ06，其中LJ06最為明顯（見圖1）。

選擇LJ03，LJ04和LJ06，分別以107CFU/mL的浸泡濃度，對仿刺參幼參進(jìn)行毒性試驗(yàn)。經(jīng)2周的連續(xù)觀察，3株細(xì)菌對幼參均無刺激排臟的作用，且實(shí)驗(yàn)期間無幼參死亡，說明這3株海泥可培養(yǎng)細(xì)菌對仿刺參是安全的，可以作為潛在的有益菌。

2.4 潛在益生菌對燦爛弧菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

圖1 3株海泥可培養(yǎng)細(xì)菌（LJ03，LJ04和LJ06）體外拮抗?fàn)N爛弧菌LJ08（牛津杯法）Fig.1 In vitro activity of three bacterial isolates（LJ03，LJ04and LJ06）against Vibrio splendidus LJ08with Oxford cup assay

在先前的毒性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)仿刺參幼參排臟現(xiàn)象往往先于死亡，而且比較容易觀察，因此選擇排臟率作為潛在有益菌拮抗?fàn)N爛弧菌的指標(biāo)。選擇LJ03，LJ04和LJ06這3株細(xì)菌進(jìn)行仿刺參幼參燦爛弧菌的拮抗實(shí)驗(yàn)。其中陽性對照組和添加LJ04拮抗組在實(shí)驗(yàn)的第一天就發(fā)生排臟現(xiàn)象，LJ03拮抗組和空白對照組的幼參分別是在第二天和第三天出現(xiàn)排臟，而LJ06拮抗組僅在第九天出現(xiàn)排臟。實(shí)驗(yàn)3d后各實(shí)驗(yàn)組排臟現(xiàn)象趨于穩(wěn)定，直至第九天再次出現(xiàn)持續(xù)排臟現(xiàn)象。LJ06拮抗組3個(gè)平行僅在第九天出現(xiàn)1例的排臟。在實(shí)驗(yàn)的第十二天，添加LJ04、LJ03和LJ06拮抗組實(shí)驗(yàn)水體 中的燦 爛弧菌數(shù) 量分別為 （1.12±0.20）×106CFU/mL、（7.31±1.10）×105CFU/mL和（1.74±0.40）×105CFU/mL，而陽性對照組燦爛弧菌數(shù)量為（2.31±0.70）×107CFU/mL，LJ04、LJ03和LJ06拮抗組與陽性對照組差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步說明了3株海泥可培養(yǎng)細(xì)菌對燦爛弧菌均有不同程度的抑菌作用，與牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)過2周的人工拮抗實(shí)驗(yàn)，空白對照組的累計(jì)排臟率為（5.00±1.00）%；僅添加燦爛弧菌的陽性對照組累計(jì)排臟率為（52.78±4.81）%；而添加LJ04、LJ03和LJ06拮抗組的累計(jì)排臟率分 別 為 （38.89±4.82）%、（36.11±4.81）% 和（2.78±4.81）%，且LJ06拮抗組的累計(jì)排臟率低于空白對照組（見圖2）。統(tǒng)計(jì)分析顯示：LJ03和LJ06拮抗組和陽性對照組差異顯著（P＜0.05），說明LJ03和LJ06具有很好的保護(hù)仿刺參幼參的作用。去除空白對照組的累計(jì)排臟率，計(jì)算獲得的LJ03和LJ06對仿刺參幼參的排臟保護(hù)率分別為34.9%和104.7%。但是，LJ04拮抗組和陽性對照組的排臟率沒有顯著差異（P＞0.05），說明LJ04在活體的實(shí)驗(yàn)中其拮抗作用不顯著。

圖2 仿刺參養(yǎng)殖區(qū)海泥中潛在有益菌對燦爛弧菌LJ08的拮抗實(shí)驗(yàn)Fig.2 In vivo inhibitory effects of potential probiotics isolated from sea cucmber area against Vibrio splendidus LJ08

2.5 潛在益生菌LJ06的形態(tài)和主要生理生化特征

菌株LJ06能在2216E瓊脂平板上生長，形成規(guī)則的圓形白色菌落，表面光滑濕潤，邊緣整齊，培養(yǎng)24h菌落直徑約為1.0mm，單菌落培養(yǎng)24h后產(chǎn)生明顯的透明圈，培養(yǎng)4d后會出現(xiàn)明顯的平板液化現(xiàn)象。該菌株革蘭氏染色呈陰性，氧化酶反應(yīng)呈陽性，能夠利用硝酸鹽，產(chǎn)生吲哚。菌株LJ06能夠降解瓊脂、淀粉和藻酸鹽，不能降解酪蛋白。

3 討論

從紅島仿刺參養(yǎng)殖區(qū)的泥樣中通過2216E培養(yǎng)基分離獲得可培養(yǎng)細(xì)菌多分布在γ－變形菌綱（占總菌數(shù)的71.4%），包括假交替單胞菌（LJ01，LJ05，LJ03和LJ07）、燦爛弧菌LJ08、科爾韋爾氏希瓦氏菌LJ02等。另外厚壁菌門占28.6%，均屬于芽孢桿菌屬。通過TCBS培養(yǎng)基分離到燦爛弧菌LJ43（與LJ08相似性100%）、科爾韋爾氏希瓦氏菌LJ42（與LJ02相似性100%）和LJ-8（與食環(huán)芳烴弧菌V.cyclitrophicus相似度為98.72%）。高菲等［18］利用不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)的PCR變性梯度凝膠技術(shù)（PCR-DGGE）研究了仿刺參前腸、中腸和后腸內(nèi)含物的細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌的16SrDNA序列與目前未培養(yǎng)的、海洋沉積物環(huán)境中獲得的細(xì)菌克隆序列相似，表明仿刺參消化道的細(xì)菌群落種類結(jié)構(gòu)受棲息地環(huán)境影響較大。張文姬等［16］采用培養(yǎng)基平板分離結(jié)合16SrDNA序列測定分析了大連地區(qū)仿刺參腸道細(xì)菌可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，也發(fā)現(xiàn)其腸道可培養(yǎng)細(xì)菌包括假單胞菌屬，弧菌屬，芽孢桿菌屬，希瓦氏菌屬等10個(gè)菌屬。本研究從仿刺參養(yǎng)殖區(qū)海泥中分離獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌的分布與以上的研究結(jié)果相似。

李彬等［17］從仿刺參的附著基和腸道中均分離獲得燦爛弧菌，而且是冬春兩季的優(yōu)勢細(xì)菌，推測是造成冬、春兩季刺參發(fā)病的誘因之一。本研究從仿刺參養(yǎng)殖區(qū)海泥可培養(yǎng)細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了燦爛弧菌LJ08，通過長度為1 441bp序列的比對，與燦爛弧菌Vibriosplendidus（FN436277）具有最大的同源性（99.38%）。在微生物的分類鑒定中，如果16SrDNA序列同源性＞99%，可認(rèn)為屬于同一種；如果16SrDNA序列同源性＜98%，則認(rèn)為是不同種，如果16SrDNA序列同源性＜95%，可以認(rèn)為屬于不同屬［14］。LJ08可以在TCBS培養(yǎng)基上生長，初步鑒定為燦爛弧菌V.splendidus。在仿刺參人工浸泡感染試驗(yàn)中，107CFU/mL的LJ08可引起幼參身體萎縮、體表潰爛、口圍腫脹等病癥，并導(dǎo)致（56.25±6.12）%的排臟率和（43.75±6.33）%的死亡率，證實(shí)燦爛弧菌LJ08是引起仿刺參腐皮綜合病的主要致病菌之一。由于仿刺參不斷吞食周圍環(huán)境中的泥土和動(dòng)植物碎屑，其消化道的細(xì)菌群落種類結(jié)構(gòu)很大程度上受棲息地環(huán)境的影響［18］。燦爛弧菌是海水中的正常菌群，其致病性取決于宿主的生理狀態(tài)和養(yǎng)殖環(huán)境的理化條件。

芽孢桿菌是最早，也是應(yīng)用在水產(chǎn)最為廣泛的益生菌。然而，已有報(bào)道一些芽孢桿菌可以產(chǎn)生溶血毒素（Hemolytic Enterotoxin HBL），如蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）等，為了保證食品微生物的安全性有必要進(jìn)行溶血性檢測［14］。在溶血性檢測中發(fā)現(xiàn)LJ25（與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）GU133621相似度99.65%）、LJ33（與短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）JX188071相似度99.79%）和LJ34（與蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）JF899264相似度99.45%）都具有β溶血活性，尤其LJ34具有較強(qiáng)的溶血活性。駱文藝等［19］報(bào)道了一株能引起仿刺參“腐皮綜合征”的蠟狀芽孢桿菌。已有報(bào)道蠟樣芽孢桿菌中的部分菌株可引起的食物中毒事件［20］。因此，在篩選芽孢桿菌作為益生菌之前，非常必要對其溶血活性進(jìn)行檢測。

本研究通過對海泥中可培養(yǎng)細(xì)菌的安全性、抑菌活性和毒性的檢測，篩選出3株對燦爛弧菌有明顯抑菌作用的細(xì)菌，分別為LJ03，LJ04和LJ06。在仿刺參幼參燦爛弧菌的拮抗實(shí)驗(yàn)中，添加LJ04、LJ03和LJ06拮抗組實(shí)驗(yàn)水體中的燦爛弧菌數(shù)量明顯減少（P＜0.05），并且LJ03和LJ06顯示出良好的保護(hù)仿刺參幼參的作用（P＜0.05），其中LJ06對仿刺參幼參排臟保護(hù)率達(dá)104.7%。LJ06的16SrDNA通過長度為1 436bp序列的比對，與白色噬瓊膠菌Agarivoransalbus HE584785具有98.74%的同源性，2216E培養(yǎng)基上能夠降解瓊脂，屬于噬瓊膠菌屬（Agarivorans）。杜宗軍等［21］報(bào)道在青島近海瓊膠降解細(xì)菌篩選和多樣性分析中，分離獲得了白色噬瓊膠菌QM38，能夠降解瓊膠和產(chǎn)生白色色素。孫奕等［22］發(fā)現(xiàn)仿刺參在饑餓情況下瓊脂降解能力提高，腸道內(nèi)具有降解瓊膠活性的細(xì)菌可達(dá)腸道細(xì)菌總數(shù)的27%。馬悅欣等［23］也從仿刺參的消化道內(nèi)分離獲得一株能降解瓊膠的細(xì)菌。推測降解瓊膠的細(xì)菌應(yīng)為仿刺參腸道正常菌群的組成之一，水產(chǎn)動(dòng)物正常腸道菌群通常被認(rèn)為是其消化系統(tǒng)的有利補(bǔ)充。有關(guān)LJ06拮抗?fàn)N爛弧菌的機(jī)理目前在進(jìn)一步深入研究中。LJ06作為拮抗?fàn)N爛弧菌的新型益生菌，在仿刺參養(yǎng)殖中有著良好的應(yīng)用前景。

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