刺參高溫定向選育群體子一代耐溫性狀的分析

趙 歡, 劉石林, 楊紅生, 趙鶴凌, 林承剛

(1. 大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院 成都生物研究所, 四川 成都610041 )

刺參(Apostichopus japonicus)隸屬于棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱、楯手目、刺參科。其富含蛋白質(zhì), 黏多糖和微量元素, 具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[1-2]。近年來(lái)隨著刺參的藥用和保健價(jià)值逐步得到全球化認(rèn)識(shí), 刺參需求量不斷增加, 刺參的苗種繁育和養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展, 養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖產(chǎn)量日益提高。2011年我國(guó)刺參的養(yǎng)殖面積約為15萬(wàn)hm2, 產(chǎn)量約11萬(wàn)t, 產(chǎn)值約為200億元人民幣, 刺參已經(jīng)成為我國(guó)北方沿海主要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類(lèi)。

刺參屬于溫帶種類(lèi), 主要分布于西太平洋北部,包括中國(guó)黃渤海海域、俄羅斯東部海岸、日本和韓國(guó)沿岸等區(qū)域。水溫對(duì)刺參的生長(zhǎng)影響顯著, 刺參生長(zhǎng)的適宜溫度為 5～20℃, 最適生長(zhǎng)溫度為 10～16℃[3],當(dāng)水溫升高到一定溫度, 刺參會(huì)停止活動(dòng), 進(jìn)入“夏眠”狀態(tài)。隨著緯度的增加刺參進(jìn)入夏眠的時(shí)間而推遲, 刺參的夏眠期最短2個(gè)月, 最長(zhǎng)4個(gè)月, 一般在100 d左右。在夏眠期間刺參消化道萎縮, 靠消耗自身的能量維持生存, 體重明顯減輕。這一特殊習(xí)性延緩刺參生長(zhǎng)速度, 延長(zhǎng)養(yǎng)殖周期, 影響刺參養(yǎng)殖業(yè)的效益。近年來(lái)養(yǎng)殖業(yè)摸索出刺參南移養(yǎng)殖模式[4],一定程度上加速刺參生長(zhǎng), 獲得較好的結(jié)果, 但是由于春末到秋末的高溫限制, 養(yǎng)殖周期一般為冬季。為此利用育種技術(shù)培育具有高溫耐受性的刺參是縮短刺參養(yǎng)殖周期, 提高刺參養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑之一, 也是刺參良種培育的重要方向之一。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)利用高溫選育和定向培育獲得具有耐高溫性狀的群體, 對(duì)其高溫耐受性狀進(jìn)行了初步檢測(cè),確定其對(duì)于高溫的耐受性與普通群體相比提高1℃。

溫度是影響刺參生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖的重要因素之一, 刺參對(duì)溫度變化響應(yīng)機(jī)理的研究已逐步開(kāi)展。Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在一定恒溫(10～30℃)范圍內(nèi), 隨溫度的升高, 刺參耗氧率呈上升趨勢(shì); 隨著溫度的升高刺參體內(nèi)能量分配發(fā)生變化, 呼吸能顯著增加而生長(zhǎng)能下降; 溫度變化會(huì)引起刺參消化酶及抗氧化酶等生理活性發(fā)生改變[6-7]。隨著刺參分子生物學(xué)的展開(kāi), 已經(jīng)建立了溫度脅迫下刺參的消減文庫(kù)并對(duì)熱刺激下刺參熱休克蛋白表達(dá)量差異進(jìn)行分析[8-9]。通過(guò)上述研究初步建立了溫度脅迫對(duì)刺參影響的生理生化及分子生物學(xué)研究方法, 但目前尚未見(jiàn)將這些測(cè)定方法用于耐溫群體性狀分析的報(bào)道。為此本研究利用存活率和功能基因表達(dá)兩個(gè)檢測(cè)指標(biāo), 對(duì)比不同群體子代高溫存活率及熱休克蛋白基因表達(dá)量的變化, 對(duì)定向選育耐溫群體子代的耐溫性進(jìn)行探索, 初步驗(yàn)證選育群體耐溫性狀的可遺傳性, 為刺參耐溫良種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2009年6月在山東煙臺(tái)東方海洋科技股份有限公司海參育苗場(chǎng)隨機(jī)選取定向選育刺參群體子一代幼參 100頭, 另選取相同數(shù)量的同期煙臺(tái)野生群體幼參作為對(duì)照組, 幼參平均體長(zhǎng)為 1～2cm, 體質(zhì)量為1.8 g±1.03 g。其中定向選育刺參為本實(shí)驗(yàn)室2006年經(jīng)過(guò)高溫選育并經(jīng) 3年南移池塘養(yǎng)殖獲得的耐高溫群體。實(shí)驗(yàn)前, 幼參置于0.5 m3水槽中暫養(yǎng)7 d, 水溫維持在 23 ℃ ±0.5 ℃ ,每天按時(shí)定量投喂自行配制的人工餌料(由鼠尾藻粉、馬尾藻粉、活性干海泥各1/3 組成)。

1.2 不同群體幼參溫度耐受性實(shí)驗(yàn)

從兩個(gè)群體幼參中隨機(jī)選擇30只個(gè)體混合進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)在容積為0.35 m3的水箱中進(jìn)行, 設(shè)置4個(gè)溫度, 每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)采取緩慢升溫方法, 溫度從 23℃緩慢升至 28℃、30℃、32℃、34℃, 平均升溫幅度 0.5℃/h; 到達(dá)最高溫度后維持24 h, 后緩慢降溫恢復(fù)到常溫, 另設(shè)置常溫對(duì)照組。恢復(fù)溫度后每隔 6 h觀(guān)察一次, 并及時(shí)撈出死亡幼參,待穩(wěn)定后統(tǒng)計(jì)存活幼參數(shù)目, 確定正式實(shí)驗(yàn)溫度。

于2009年7月6日至7月23日進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。設(shè)置高溫實(shí)驗(yàn)組(32℃)和對(duì)照組(23℃), 每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)放置10頭幼參。高溫實(shí)驗(yàn)組首先快速?gòu)?3℃升溫至30℃, 并在30℃維持5 d,隨后以每天升溫 0.5℃的速度緩慢升溫至達(dá)到 32℃后保持在此溫度 8 d(圖 1)。水箱溫度由實(shí)驗(yàn)室溫度控制系統(tǒng)控制, 在溫度實(shí)驗(yàn)期間各組保持正常飼養(yǎng)、充氣和換水, 水溫變化幅度控制在 0.1℃。實(shí)驗(yàn)期間每天進(jìn)行觀(guān)測(cè), 記錄并撈出死亡個(gè)體, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄最后死亡及存活的刺參數(shù)量。

1.3 不同群體幼參熱休克蛋白基因表達(dá)量的差異

在自然水溫為 23℃時(shí), 從不同群體中隨機(jī)選擇40只幼參直接放入 28℃水體中進(jìn)行急性溫度刺激,在1、2、4、10、24、48 h隨機(jī)取出5只個(gè)體, 迅速保存于液氮中待測(cè)。

取刺參體壁參照Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取, 并反轉(zhuǎn)成cDNA模板。反轉(zhuǎn)反應(yīng)體系如下: 1 μL總 RNA, 0.5 μL oligo dT(10mmol/L), 0.25 μL RNase Inhibitor(40 U/μL), 0.5μL NTP(2.5mmol/L), 1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U)加水至10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件如下: 42℃ 1 h, 94℃ 90 s, 4℃10 min。

利用Real time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)(Mastercycler? ep realplex, Eppendorf)測(cè)定 Hsp90及 Hsp26基因表達(dá)量。根據(jù) Genebank中已有的刺參 Hsp90序列(HQ-689677), Hsp26序列(HQ689678)及β-actin序列信息(EU668024)合成引物(表 1)。反應(yīng)體系包括: 12.5 μL SYBR Green PCR Master Mix(Takara), 0.5 μL Forward primer(10μmol/L), 0.5 μL Reverse primer (10μmol/L),2 μL cDNA, 用水補(bǔ)充至終體積25 μL。反應(yīng)條件如下: 95℃變性10 s, 然后95℃5 s, 59℃20 s, 72℃ 30 s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。溶解反應(yīng)的條件為 65～92℃, 每升0.2℃保持1 s讀板記錄熒光量。獲得的溶解曲線(xiàn)都為單一峰, 確定產(chǎn)物特異性擴(kuò)增。Hsp90及 Hsp26基因表達(dá)水平計(jì)算以β-actin為內(nèi)參, 對(duì)得到的各樣品 Ct值進(jìn)行均一化處理, 應(yīng)用 2-ΔΔCt確定不同溫度應(yīng)激時(shí)間的Hsp90及Hsp26基因的相對(duì)含量(表 1)。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer information in this experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)不同群體刺參幼參存活率及基因表達(dá)相對(duì)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 并進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P < 0. 05 表示有差異顯著性。所有的結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同群體子一代幼參耐高溫性能比較

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用 4個(gè)不同的溫度梯度對(duì)幼參進(jìn)行溫度刺激, 整個(gè)過(guò)程及時(shí)撈出死亡個(gè)體, 記錄存活數(shù)量,計(jì)算存活率。結(jié)果顯示: 28℃和30℃刺激條件下混合群體刺參幼參存活率在 95%和 90%以上, 而溫度達(dá)到34℃時(shí)刺參幼參大量死亡, 在 32℃時(shí)刺參幼參的存活率為60%, 接近半數(shù)致死溫度, 故選擇32℃作為刺參幼參高溫存活率檢測(cè)溫度, 進(jìn)行下一步大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)緩慢升溫和維持高溫的方式進(jìn)行慢性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在緩慢升溫至30℃并維持在30℃這段時(shí)間里各群體子一代幼參沒(méi)有出現(xiàn)死亡, 但是明顯出現(xiàn)幼參黏附能力弱, 活動(dòng)能力差的現(xiàn)象, 這與預(yù)實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果相一致。隨著溫度逐步升高至32℃, 兩個(gè)群體子一代幼參都開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的個(gè)體死亡現(xiàn)象, 存活率不斷下降。定向選育群體子一代幼參在高溫脅迫下表現(xiàn)出與其親體相同的溫度耐受性, 在 30℃至 32℃的溫度變化過(guò)程中存活率始終高于野生群體。隨著時(shí)間的延長(zhǎng), 兩個(gè)群體不斷有幼參死亡, 待穩(wěn)定后計(jì)算存活率。結(jié)果顯示, 定向選育群體子一代幼參存活率為 80.00±10.00, 與野生群體存活率(56.67±5.77)存在顯著性差異(P<0.05, 圖2)。

圖2 高溫刺激條件下不同群體存活率變化趨勢(shì)Fig.2 Survival trend of different population of A. japonicus under heat stress

2.2 高溫刺激下不同群體子一代幼參Hsp90及Hsp26基因表達(dá)量的變化

利用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在熱刺激過(guò)程中刺參 β-actin基因表達(dá)沒(méi)有明顯變化, 故選擇其作為內(nèi)參基因評(píng)價(jià)熱休克蛋白基因表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著熱刺激時(shí)間的增加, 各個(gè)群體子一代幼參熱休克蛋白基因表達(dá)都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),野生群體在熱刺激1 h時(shí) Hsp90及Hsp26基因表達(dá)達(dá)到最高峰, 而定向選育群體則在熱刺激 2 h時(shí)Hsp90及 Hsp26基因表達(dá)達(dá)到最大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)各群體子一代幼參熱休克蛋白基因表達(dá)逐漸下降,24 h時(shí)各群體基因的表達(dá)量幾乎恢復(fù)到刺激前水平。對(duì)比不同群體基因表達(dá)特征發(fā)現(xiàn), 在常溫狀態(tài)下,定向選育群體熱休克蛋白基因含量略高于野生群體,但兩個(gè)群體差異不顯著; 高溫刺激誘導(dǎo)兩個(gè)群體子一代幼參熱休克蛋白基因表達(dá)量增加, 但是定向選育群體子一代幼參Hsp90及Hsp26基因最大表達(dá)量低于野生群體(P＜0.05, 圖3)。

圖3 高溫刺激下不同群體子代幼參Hsp90(A)和Hsp26(B)基因表達(dá)量比較Fig.3 Comparison of Hsp90 (A) and Hsp26 (B) mRNA expression in different populations of A. japonicus under heat stress

3 討論

為了推進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展, 利用選育種技術(shù)開(kāi)展優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆品種的選育已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于刺參選育種的工作已起步, 常亞青等獲得中俄雜交群體, 并發(fā)現(xiàn)該群體具有較好的耐低溫能力[10]。魏玉峰等[11]對(duì)煙臺(tái)和青島海域的野生刺參群體進(jìn)行選種繁育, 對(duì)不同選育組合稚幼參生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析, 表明選育組合的稚幼參生長(zhǎng)率高于自交對(duì)照組。

耐高溫群體的選育研究目前已經(jīng)在魚(yú)類(lèi)等海洋經(jīng)濟(jì)物種中已廣泛開(kāi)展, Brett等[12]在高溫條件下選育了虹鱒(Salmo graidneri Richard)群體, 發(fā)現(xiàn)其體長(zhǎng)、體重高于對(duì)照組。作為中國(guó)主要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一, 刺參耐溫群體選育的研究目前較少。黃大宏等[13]選育獲得速生耐溫群體, 對(duì)其生長(zhǎng)性狀進(jìn)行檢測(cè)。崔靜等[14]研究了刺參南移養(yǎng)殖過(guò)程中的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化, 并構(gòu)建了南移養(yǎng)殖刺參cDNA文庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)室在近年來(lái)開(kāi)展了部分高溫定向選育工作, 利用高溫脅迫定向選育獲得了部分耐高溫刺參群體,對(duì)該群體的耐溫性狀亦進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)選育群體比普通群體高溫耐受性提高了1℃。為了驗(yàn)證該群體耐溫性狀是否穩(wěn)定遺傳, 本實(shí)驗(yàn)對(duì)定向選育群體子代的耐溫性進(jìn)行驗(yàn)證。

群體耐高溫性能的不同會(huì)受到內(nèi)部因素和外部因素的雙重影響, 為了消除外部因素(包括鹽度、飼料的投喂等)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響, 本實(shí)驗(yàn)盡量使養(yǎng)殖條件達(dá)到一致, 從而減少這些環(huán)境因子對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差, 以確保實(shí)驗(yàn)獲得的耐溫性能差異主要來(lái)自于不同群體之間的差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比兩個(gè)群體子一代幼參高溫耐受性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫脅迫條件下定向選育群體子一代幼參存活率高于野生群體幼參, 表現(xiàn)對(duì)高溫較好的耐受性。已有研究表明耐熱性與馴化溫度有相關(guān)性, 一定范圍內(nèi), 提高馴化溫度可以提高其耐熱性。在 20℃馴化 0.5 g的幼參亞致死溫度為30℃, 致死溫度為34℃[8]。在18℃馴化2～3 d, 1.8 g幼參的起始致死溫度(TL50)上限為25℃, 190 g成參為 26.8℃, 成參臨界熱最大值(CTM)為 29.2℃。在22℃馴化后幼參 TL50上限為 27.2℃, 成參為 28℃,成參CTM為29.5℃[15]。馴化是可逆的非遺傳性的轉(zhuǎn)變, 其引起的致死溫度的改變不能遺傳。而定向選育群體經(jīng)歷了高溫選育, 篩選出的親體是對(duì)高溫具有耐受性的個(gè)體, 且該群體又經(jīng)歷南移養(yǎng)殖定向培育,其不再是簡(jiǎn)單的馴化, 因此其耐溫性狀存在遺傳的可能性。

熱休克蛋白(heat shock proteins, Hsps)是生物體在不利環(huán)境因素刺激下應(yīng)激合成的一類(lèi)具有重要生理功能的蛋白質(zhì)分子伴侶, 異常溫度下生物體內(nèi)Hsps的變化情況及功能研究是研究溫度脅迫的一個(gè)重要指標(biāo)。大量研究表明Hsps水平的變化可以反映應(yīng)激物的存在。溫度變化可導(dǎo)致襟疣?？?Anthopleura elegantissima、海膽Paracentrotus lividus、貝類(lèi)Hsps表達(dá)量顯著變化[16-18]。刺參遭受溫度急性變化時(shí), Hsps也會(huì)做出快速積極響應(yīng)。驟然升溫會(huì)導(dǎo)致刺參Hsp70的表達(dá)迅速升高, 在3 h時(shí)達(dá)到最大值,在12 h后持續(xù)下降, 直到恢復(fù)到接近初始水平[19]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)定向選育群體在高溫及常溫條件下Hsp70的基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定, 初步確定了Hsp70基因表達(dá)與群體耐溫性能的相關(guān)性[20]。前期由于刺參分子研究背景的缺乏, 溫度脅迫應(yīng)激蛋白的研究主要集中于Hsp70, 在獲得刺參Hsp90和Hsp26基因全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上, 本實(shí)驗(yàn)選取這兩個(gè)基因作為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)分析不同群體子一代個(gè)體耐溫性狀。結(jié)果表明在高溫刺激下各群體子一代幼參Hsp90和Hsp26基因表達(dá)量都增加, 變化趨勢(shì)中的相同性說(shuō)明在高溫刺激下各群體的生理平衡都受到破壞, 誘導(dǎo)熱休克蛋白基因大量表達(dá), 修復(fù)受損的蛋白質(zhì), 維持機(jī)體穩(wěn)定性。但不同群體Hsp90和Hsp26基因表達(dá)存在差異,定向選育群體基因表達(dá)最高峰出現(xiàn)的時(shí)間晚于野生群體, 并且定向選育群體基因轉(zhuǎn)錄水平較野生對(duì)照組低。定向選育群體刺參經(jīng)過(guò)高溫選育和南移養(yǎng)殖,其體內(nèi)Hsps可能存在一定的積累, 子一代具有同親代刺參相同的Hsps組織積蓄性, 因此Hsps合成有滯后現(xiàn)象。

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