雜色龍蝦線粒體基因組全序列的測定與分析

劉 皓, 姚 維, 劉海情, 劉楚吾, 劉 麗

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025)

動物線粒體基因組(mitochondrial DNA, mtDNA)是核外遺傳物質(zhì), 結(jié)構(gòu)簡單, 具有典型的母系遺傳特征[1], 受精時, 父本 mtDNA 無法進(jìn)入卵細(xì)胞, 受精卵的 mtDNA直接來自母本, 不存在父母雙方mtDNA的重組過程。mtDNA進(jìn)化速度相對較快, 大約是單拷貝核基因進(jìn)化速度的6～7倍[2-3]。mtDNA還缺少具有校對功能的酶, 呈游離裸露狀態(tài)且無組蛋白的保護(hù), 由于其修復(fù)系統(tǒng)不健全、代增時間比較短和選擇壓力小等原因, 造成的突變很容易固定下來。盡管動物線粒體在基因組成上具有很高的保守性,但在種群內(nèi)或不同物種間存在較大的差異[2,4-6]。利用這種高效的單倍體母系遺傳方式以及差異性,只需少量材料就能反映群體的遺傳結(jié)構(gòu), 可縮減用于測有效種群的群體大小, 提高對遺傳漂變的敏感性, 便于進(jìn)行群體分析[7]。后生動物 mtDNA為典型的環(huán)狀雙鏈分子結(jié)構(gòu), 長度大多在14～18 kb,編碼 37個基因, 包括 13個蛋白質(zhì)基因、22個tRNA基因以及12s rRNA和16s rRNA基因[8]。近年來, 研究者們非常關(guān)注后生動物 mtDNA的基因排列, 主要是因?yàn)樗茄芯肯到y(tǒng)進(jìn)化的一個很好的模型[9-12]。

作者報道了雜色龍蝦的線粒體基因組全序列特征, 并在雜色龍蝦(Panulirus versicolor)、中國龍蝦(Panulirus stimposni)、波紋龍蝦(Panulirus homarus)3個物種線粒體基因組全序列的基礎(chǔ)上分析了龍蝦屬線粒體基因組多態(tài)位點(diǎn)及遺傳變異, 為進(jìn)一步從分子水平對龍蝦類的分類研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用雜色龍蝦樣品來自廣東湛江霞山水產(chǎn)品市場, 取其肌肉, –20℃保存于無水乙醇中備用。

1.2 基因組總DNA的提取

以雜色龍蝦的肌肉為實(shí)驗(yàn)材料, 參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》, 采用苯酚-氯仿法提取基因組總DNA[13]。并利用核酸定量儀檢測DNA的濃度和純度,然后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計

利用甲殼動物cox1,nad5和Cytb 3種編碼基因的通用引物擴(kuò)增出 3個片段[14-16]。然后在 GenBank中選取與雜色龍蝦線粒體基因組同源性比較高的 3個物種(中國龍蝦(NC014339)、日本龍蝦(Panulirus japonicus)(NC004251)和錦繡龍蝦(Panulirus ornatus)(NC014854)[17-19])的序列進(jìn)行序列比對, 選取保守性較高的區(qū)域, 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計了19對PCR引物(表 1), 覆蓋雜色龍蝦線粒體基因組全序列, 引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系: 反應(yīng)總體積為 25 μL, 其中,10×Buffer 2.5 μL, dNTP2 μL, 上下游引物各 1 μL,TaqDNA聚合酶0.15 μL, DNA模板1 μL, 去離子水18.35 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性20 s, 48～58℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收及測序

取PCR產(chǎn)物2 μL在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳, 凝膠成像儀拍照記錄。用QIAquick Gel Extraction 50柱式膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物, 純化的步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。取適量純化產(chǎn)物作為測序反應(yīng)的模板, 委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 序列拼接及分析

所測得序列用Lasergeneversion 7.0(DNASTAR)軟件包進(jìn)行分析, 用Seqman對重疊群進(jìn)行拼接, 然后用Clustal W軟件對拼接后的序列進(jìn)行人工校對。參考中國龍蝦、日本龍蝦和錦繡龍蝦的線粒體基因組 DNA數(shù)據(jù)對所獲得序列的蛋白編碼基因、rRNA和tRNA基因進(jìn)行識別, 并通過tRNAscan-SE搜索服務(wù)器(http: //lowelab.ucsc.edu/t RNAscan-SE/)[20]進(jìn)行識別tRNA的再驗(yàn)證。利用MEGA5.0[21]分析各種區(qū)段的堿基組成特征, 密碼子使用頻率, 通過 DnaSP 4.10.7[22]分析龍蝦屬線粒體基因組的編碼基因多態(tài)位點(diǎn)和基因變異特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜色龍蝦線粒體基因組全序列的基本特征

雜色龍蝦mtDNA全長為15 700 bp(GenBank登錄號為JQ320274), 由13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)以及D-loop控制區(qū)組成(表2)。其中14個基因位于輕鏈(L)上, 分別為12S rRNA, 16S rRNA,nad1,nad4L,nad4,nad5,tRNAVal,tRNALeu-CUN,tRNAPro,tRNAHis,tRNAPhe,tRNACys,tRNATyr,tRNAGln, 其余23個基因位于重鏈(H)上。

表2 雜色龍蝦線粒體基因組組成Tab.2 Gene organization of P. versicolor mitochondrial genome

雜色龍蝦線粒體基因組存在11處基因重疊, 重疊區(qū)長度1～6 bp不等, 基因間隔有10處, 大小在1 ～36 bp,基因間隔最大的在tRNASer與nad1和nad1與tRNALeu之間, 分別是 17 bp和 36 bp; 既沒有重疊,也沒有間隔的基因共計15處。雜色龍蝦線粒體DNA的堿基組成具有AT偏好性, A+T含量為67%, 4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%, C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢與其他甲殼動物基本一致, A含量最高而G含量最低, 在A+T富集區(qū)表現(xiàn)更為明顯。

線粒體基因排列能夠提供重要的系統(tǒng)進(jìn)化信息,一般而言, 泛甲殼動物的線粒體基因組的基因排列順序基本相同, 但十足目較為復(fù)雜。作者研究的雜色龍蝦保持了泛甲殼動物線粒體基因組的原始排列,沒有出現(xiàn)重組/隨機(jī)丟失現(xiàn)象。

2.2 蛋白編碼基因

在雜色龍蝦線粒體基因組中, 參與蛋白質(zhì)編碼的基因有13個(表3), 核苷酸共11140 bp, 占全序列的70.96%。雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間的重疊情況一致, 均重疊 7個堿基。除cox1和nad2外, 其余的11個蛋白質(zhì)編碼基因都以標(biāo)準(zhǔn)的ATN作為起始密碼子。nad2的起始密碼子為GTG,cox1的起始密碼子為ACG。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA,在后生動物中這種不完全密碼子比較常見。Ojala等[23]的研究表明, 成熟的終止密碼子 TAA 可以通過轉(zhuǎn)錄后的多腺苷酸化產(chǎn)生。

表3 雜色龍蝦粒體基因組13個蛋白編碼基因密碼子使用情況Tab.3 Average codon frequencies and usage in the 13 mitochondrial protein-coding genes in P. versicolor

2.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦mtDNA序列與其他物種一樣, 也包含22個tRNA基因。除tRNALeu和tRNASer有2個, 其他18個均只有1個序列。每個tRNA均能折疊成三葉草狀二級結(jié)構(gòu), 長度為61～75 bp不等。12s rRNA基因位于tRNAVal和 D-loop之間, 長度為 861 bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長度為1 460 bp。兩個rRNA基因都位于輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致。本研究成功地預(yù)測出 18個tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)和兩個rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)。預(yù)測到的12s rRNA的二級結(jié)構(gòu)含有3個結(jié)構(gòu)域, 40個莖環(huán)結(jié)構(gòu), 它的3'端存在一個莖環(huán)結(jié)構(gòu); 16s rRNA二級結(jié)構(gòu)都有6個結(jié)構(gòu)域, 53個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

在相近種種間或種內(nèi)的遺傳變異分析研究中,選取分子標(biāo)記片段至關(guān)重要。本研究在中國龍蝦, 雜色龍蝦, 波紋龍蝦 3個物種線粒體基因組全序列基礎(chǔ)上分析了龍蝦屬線粒體基因組13個蛋白質(zhì)編碼基因、D-loop及2個核糖體RNA 基因的多態(tài)位點(diǎn)分析(表 4)。結(jié)果顯示: 多態(tài)位點(diǎn)比例較大的基因有nad2、nad4、nad5、Cytb、D-loop。

3 討論與結(jié)論

3.1 雜色龍蝦線粒體基因組全序列

雜色龍蝦線粒體基因組序列全長15 700 bp, 稍大于中國龍蝦[18]的15 677 bp, 而稍小于日本龍蝦[17]的15 717 bp, 在軟甲亞綱的范圍內(nèi)。雜色龍蝦線粒體基因組的基因排列次序與其他龍蝦類及節(jié)肢動物的基本模式相同, 沒有KD倒置現(xiàn)象, 即tRNAAsp(D)排在tRNALys(K)基因上游(DK排列)[24]。雜色龍蝦線粒體DNA的堿基組成具有很強(qiáng)的 AT偏好性, A+T含量為 67%, 稍高于中國龍蝦的 65.6%和日本龍蝦的64.5%。4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%,C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢與其他甲殼動物基本一致, A含量最多而G含量最少, 在A+T富集區(qū)表現(xiàn)更為明顯, 這與線粒體含有大量 ATP有著密切的聯(lián)系。蛋白質(zhì)基因nad4和nad4L,atp6、atp8和cox3緊密相連, 沒有tRNA基因的間隔, 這也說明存在于蛋白質(zhì)編碼基因間的tRNA二級結(jié)構(gòu)是多順反子, 在轉(zhuǎn)錄過程中不進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼基因間隔序列的形成[25]。

表4 龍蝦屬線粒體基因組13個蛋白質(zhì)編碼基因、D-loop及2個核糖體RNA基因的多態(tài)位點(diǎn)分析Tab.4 Polymorphic loci analysis of 13 protein-coding genes, D-loop and two ribosomes RNA gene in Lobster (Panulirus) mitochondrial genome

3.2 蛋白質(zhì)編碼基因

與日本龍蝦及中國龍蝦一樣, 雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間均重疊7個堿基。除cox1的起始密碼子為ACG、nad2的起始密碼子為GTG外, 其余的11個蛋白質(zhì)編碼基因都以標(biāo)準(zhǔn)的ATN作為起始密碼子。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA, 在后生動物中這種不完全密碼子比較常見。Ojala等[23]的研究表明,成熟的終止密碼子 TAA 可以通過轉(zhuǎn)錄后的多腺苷酸化產(chǎn)生。

從表 3可以看出, 雜色龍蝦組成蛋白質(zhì)的氨基酸中按數(shù)目的多少排列分別為: Ser, Leu, Ile, Phe, Tyr,Pro, Asn, Thr, Lys, Met, Gln, Val, His, Ala, Glu, Arg,Gly, Asp, Trp, Cys。這與已知的龍蝦屬其他物種的氨基酸排列順序大致相同, 說明龍蝦屬各物種的蛋白質(zhì)編碼基因序列之間的替換多為同義替換, 沒有影響所編碼的氨基酸種類。在雜色龍蝦線粒體基因組中, 占主導(dǎo)地位的是非極性氨基酸, 其次是極性不帶電的氨基酸。根據(jù)生物分子的相似相溶性原理可知, 其線粒體DNA所編碼的蛋白質(zhì)為疏水蛋白質(zhì)。另外, 從編碼同一個氨基酸不同密碼子的使用個數(shù)和百分比來看, 三聯(lián)密碼子的第三位點(diǎn)有 4種擺動形式, 第三位點(diǎn)為 G的密碼子使用個數(shù)較少, 這也反映了線粒體蛋白質(zhì)編碼基因在使用密碼子上的明顯偏好, 即反G偏倚。

3.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦 mtDNA也編碼 22個tRNA基因。tRNALeu和tRNASer有 2個序列, 其他 18個均只有 1個序列。長度范圍為 61～75 bp。所預(yù)測到的二級結(jié)構(gòu), 僅tRNASer無DHC臂, 由7個核苷酸取代了該位置, 其余的tRNA都能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu), 這是后生動物線粒體基因組的一個普遍特征。雜色龍蝦的18個tRNA的二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)16處錯配, 其中14處為 GU錯配, 2處 UU錯配, 發(fā)生在tRNATyr和tRNAGln的氨基酸接受臂和TψC臂。有學(xué)者認(rèn)為線粒體基因組tRNA基因的部分錯配可以通過RNA編輯校正, 不會引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)上的障礙[26]。12s rRNA基因位于tRNAVal和D-loop之間, 長度為861bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長度為1 460 bp。兩個rRNA基因都編碼在輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致[17-18]。預(yù)測到的雜色龍蝦 16s rRNA二級結(jié)構(gòu), 有6個結(jié)構(gòu)域, 53個莖環(huán)結(jié)構(gòu); 12srRNA的二級結(jié)構(gòu)含有 3個結(jié)構(gòu)域, 40個莖環(huán)結(jié)構(gòu),它的3'端存在一個莖環(huán)結(jié)構(gòu), Cannone等[27]認(rèn)為12s rRNA和類似12srRNA的二級結(jié)構(gòu)都存在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)。雜色龍蝦的rRNA二級結(jié)構(gòu)與其他脊椎動物的基本相同[28], 這說明rRNA基因進(jìn)化非常慢, 在相當(dāng)長的進(jìn)化過程中, 其分子的排列變化不大, 功能幾乎保持恒定。

3.4 A+T富集區(qū)

目前對A+T富集區(qū)域的關(guān)注主要集中于所包含的與復(fù)制相關(guān)的調(diào)控信息。由于其在進(jìn)化過程中選擇壓力相對較小, 較線粒體其他區(qū)域具有更高的多態(tài)性, 不同種類動物線粒體DNA大小的差異主要是由該區(qū)域的變化造成的[29]。雜色龍蝦控制區(qū)與其他后生動物的相似, 主要包括5個結(jié)構(gòu): 輕鏈復(fù)制起點(diǎn)(origin of minoritystrand replication)、poly T(poly-thymidine stretch)結(jié)構(gòu)、高度變異區(qū)、類似微衛(wèi)星的重復(fù)序列以及靠近tRNAIle上游的一段 poly T結(jié)構(gòu)[30-31],這段Poly(T)結(jié)構(gòu), 與復(fù)制起點(diǎn)的識別有關(guān)[32]。

3.5 基因多態(tài)位點(diǎn)分析

通常cox1、Cytb被認(rèn)為適用于近緣物種的區(qū)分和鑒定, 在群體遺傳、分類學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、動物保護(hù)生物學(xué)以及古生物化石等研究方面得到了廣泛的應(yīng)用[33-35]。本研究中, 通過對多態(tài)位點(diǎn)的分析得知:cox1的多態(tài)位點(diǎn)比例較低, 不適宜用于龍蝦類分子進(jìn)化研究。nad2、D-loop基因的多態(tài)位點(diǎn)比例較高, 尤其是D-loop, 高達(dá)39.50%, 且基因片段較長, 而nad5基因擁有的多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)最多(>400), 因此, 他們比較適合作為分子標(biāo)記用于分析龍蝦類生物進(jìn)化過程中的譜系發(fā)生和遷移流動以及群體間線粒體基因組進(jìn)化全序列比較分析、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、種內(nèi)多態(tài)性研究、遺傳分化等。

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