桑杏湯對(duì)兩種細(xì)菌的最低抑菌濃度測(cè)定及意義

倪圣，丁建中，黃江榮，李侃

（長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023）

桑杏湯出自清代醫(yī)家吳瑭所著 《溫病條辨》卷一之上焦篇方，“秋感燥氣，右脈數(shù)大，傷手太陰氣分者，桑杏湯主之?！贝朔捷p宣溫燥，涼潤(rùn)止咳，故能 “清氣分之燥也”。近年來(lái)對(duì)桑杏湯及其加減方治療呼吸系統(tǒng)疾病隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究文獻(xiàn)的Meta分析顯示，對(duì)1310例肺炎、咳嗽變異性哮喘、咳嗽、支氣管炎等受試者療效良好［1－2］。前期研究證實(shí)桑杏湯可促進(jìn)氣道黏液分泌及增加氣道IgG抗體水平，可能是治療呼吸系統(tǒng)疾病的生物學(xué)基礎(chǔ)之一［3］。本實(shí)驗(yàn)采用制備含桑杏湯復(fù)方水提取物瓊脂平板法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌（簡(jiǎn)稱金葡菌）和銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibition concentration，MIC），為解析桑杏湯治療溫燥傷肺機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱，溫度（6～65）±1℃（上海醫(yī)療器械廠）；細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管（DensiCHEK，BioMerieux.Inc，27704－0969／USA）；M－H 藥 物 敏 感 試 驗(yàn) 瓊 脂（批 號(hào)：20131114， 產(chǎn) 品 編 號(hào)：HB6232，青島高科園海濤生物技術(shù)有限公司）；微量移液器（2～10μl，100μl，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC29213）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）質(zhì)控菌株由原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材

桑杏湯源自 《溫病條辨》：桑葉9g，杏仁9g，沙參15g，象貝母12g，香豉6g，梔子皮12g，梨皮12g。中藥材購(gòu)自湖北清大中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定教研室鑒定為合格藥材。

1.4 中藥液制備

取桑杏湯一劑，加3倍水浸泡2h后微火煎至100ml，重復(fù)3次，3次煎液過(guò)濾混勻并水浴濃縮至200ml，其生藥量為0.360g／L。待藥液冷卻至室溫后3500r／min離心20min，取上清液備用。

1.5 菌液制備

取經(jīng)BioMerieux專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種18h的金葡菌、銅綠假單胞菌用無(wú)菌生理鹽水制成懸液，用細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108個(gè)／ml），當(dāng)天使用。

1.6 含中藥MH培養(yǎng)基制備

在多次預(yù)試驗(yàn)后，取MH瓊脂、按表1配制不同濃度（mg／ml）的培養(yǎng)基，用1mol／L NaOH調(diào)整pH為7.4，經(jīng)121℃、15min后備用；瓊脂厚度4mm，常規(guī)檢菌試驗(yàn)合格；對(duì)照組用無(wú)菌生理鹽水代替藥物。用記號(hào)筆在每個(gè)含藥培養(yǎng)基底部標(biāo)記分區(qū)以便接種細(xì)菌懸液。

表1 桑杏湯水提取物藥物敏感試驗(yàn)培養(yǎng)基制備 最終生藥濃度：mg／ml

1.7 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

取0.1ml細(xì)菌懸液（1×108CFU／ml）于無(wú)菌EP管中經(jīng)無(wú)菌生理鹽水稀釋為1×105CFU／ml，于每個(gè)培養(yǎng)基的3個(gè)分區(qū)分別接種2μl，經(jīng)（36.5±0.5）℃、24h后，證實(shí)全部培養(yǎng)基無(wú)污染菌生長(zhǎng)后，用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)器記數(shù)菌落，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)濃度為 MIC，參照同類(lèi)實(shí)驗(yàn) MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)［5］：＜7.81mg／ml生藥濃度為高度敏感，7.81～250.0mg／ml生藥濃度為中度敏感，＞250.0mg／ml生藥濃度時(shí)為不敏感［4］。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 細(xì)菌菌落鑒定

在確認(rèn)無(wú)雜菌污染基礎(chǔ)上進(jìn)行革蘭染色；對(duì)可疑金葡菌菌落進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)：在盛有1∶4新鮮兔血漿0.5ml的試管中加入各平板生長(zhǎng)24h可疑菌落制備的菌液0.5ml，搖蕩均勻，放入（37±1）℃恒溫箱中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，連續(xù)觀察6h，呈現(xiàn)凝塊狀為陽(yáng)性；同時(shí)用金葡菌質(zhì)控菌株和陰性肉湯作為對(duì)照。對(duì)銅綠假單胞菌采用革蘭染色與菌落色素進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果

桑杏湯水提取物對(duì)金葡球的MIC為25mg／ml，對(duì)綠膿假單胞菌的MIC為200mg／ml。見(jiàn)表1。

表2 桑杏湯水提取物對(duì)兩種細(xì)菌的MIC值 mg／ml

3 討論

革蘭陽(yáng)性金葡球在環(huán)境和人體體表、體內(nèi)廣泛存在，上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，通過(guò)其毒素和侵襲性酶引起肺炎、敗血癥等化膿性感染和醫(yī)源性感染的主要細(xì)菌之一；革蘭陰性銅綠假單胞菌在皮膚、呼吸道、腸道廣泛存在，在機(jī)體抵抗力降低、長(zhǎng)期應(yīng)用激素或抗生素時(shí)易導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染，也是常見(jiàn)的醫(yī)源性感染病原菌，故本實(shí)驗(yàn)采用上述兩種病原菌進(jìn)行MIC實(shí)驗(yàn)。鑒于國(guó)內(nèi)尚無(wú)測(cè)定中草藥對(duì)細(xì)菌MIC的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，故本實(shí)驗(yàn)參照同類(lèi)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，首次測(cè)得桑杏湯水提取物對(duì)金葡菌和綠膿假單胞菌的MIC分別25mg／ml和200mg／ml（生藥濃度），表明桑杏湯對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌具有良好抑菌作用（或中度敏感），且對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭陰性菌，其機(jī)理有待研究。

實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)桑杏湯達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)的0.360g／L水煎劑濃度時(shí)較為黏稠，采用0.45μm真空抽濾除菌法費(fèi)時(shí)且需大量藥液，又要兼顧根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求精確制備在每個(gè)含15ml培養(yǎng)基中達(dá)到實(shí)驗(yàn)規(guī)定的中藥生藥濃度瓊脂平板，優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)菌的MIC，方法簡(jiǎn)捷、直觀、結(jié)果可靠并易發(fā)現(xiàn)污染菌，尤其是上述濃度制備的含藥瓊脂平板雖然具有一定顏色的淺棕色色素，但同時(shí)具有良好的透明度而能清晰、有效地進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。制備含藥瓊脂平板缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要考慮到中藥復(fù)方水煎提取過(guò)程中產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，更受到制備MH瓊脂需經(jīng)高壓滅菌處理等導(dǎo)致抗菌物質(zhì)活性降低或有效成分被破壞，使其抑菌活性降低并導(dǎo)致MIC值偏高［6］，為進(jìn)一步研究桑杏湯復(fù)方藥物成分的“抗菌清熱”作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)提供重要基礎(chǔ)。

值得注意的是，在連續(xù)5次按照常規(guī)程序、將新制成的1×104CFU／ml細(xì)菌懸液用無(wú)菌微量移液器在每個(gè)接種點(diǎn)上接種2μl后，其結(jié)果是對(duì)照組與最低濃度生藥組培養(yǎng)基上均無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，但調(diào)至1×105CFU／ml、在每個(gè)點(diǎn)上接種2μl后生長(zhǎng)良好且遞度明顯，故本實(shí)驗(yàn)采用的接種細(xì)菌懸液為1×105CFU／ml，此種改良方法對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)具有借鑒作用。

［1］趙勤，汪海飚，高振，等.桑杏湯（散）及其加減方治療呼吸系統(tǒng)疾病療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià) ［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：254－258.

［2］王渝，陳妙.桑杏湯加減治療咳嗽變異性哮喘臨床觀察 ［A］.海拉爾：全國(guó)中醫(yī)內(nèi)科肺系病第14次學(xué)術(shù)研討會(huì)，2010：123.

［3］丁建中，張六通，龔權(quán)，等.桑杏湯對(duì)溫燥小鼠氣管纖毛運(yùn)動(dòng)與呼吸道液及免疫功能的影響 ［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（5）：4－5.

［4］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 ［M］.3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：896－905.

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