內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp.LC18中安莎霉素類化合物的發(fā)現(xiàn)

李善仁，孟 瑾，王浩鑫，魯春華，沈月毛＊

（1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門361102；2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250012；3.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250100）

安莎霉素（ansamycins）是一類主要由微生物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)獨(dú)特的大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素，其結(jié)構(gòu)特征由一平面的芳香核和連接芳香核2個(gè)不相鄰位置脂肪鏈橋組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu).安莎霉素類化合物具有抗菌、抗腫瘤等顯著的生物活性，其中，最具代表性如利福霉素（rifmaycin）衍生物利福平是治療結(jié)核的一線藥物［1－2］；格爾德霉素（geldanamycin）和美登木素（maytansinoid）的衍生物分別用于腫瘤治療［3－5］.安莎霉素屬于I型聚酮類化合物，其生物合成是以3－氨基－5－羥基苯甲酸 （3－amino－5－h(huán)ydroxybenzoic acid，AHBA）為起始單元，通過(guò)聚酮合酶催化添加乙酸或丙酸單元組裝聚酮鏈，由酰胺合酶環(huán)化釋放聚酮鏈形成安莎前體，經(jīng)過(guò)一系列的后修飾反應(yīng)，形成不同的安莎霉素［6］.目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約200多個(gè)安莎霉素類化合物，結(jié)構(gòu)上可以分為5酮、7酮、8酮、9酮、11酮和14酮，由于聚酮鏈的延伸次數(shù)并不像大環(huán)類酯類化合物一樣連續(xù)，我們推測(cè)自然界中還可能存在其他聚酮鏈長(zhǎng)度的安莎霉素類化合物［7－8］.因此，從自然界特異生境微生物資源中篩選挖掘新型安莎霉素的潛力仍然巨大.

紅樹植物生長(zhǎng)于陸地與海洋交界帶的淺灘中，是陸地向海洋過(guò)渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)，與紅樹植物協(xié)同進(jìn)化的內(nèi)生菌是發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源［9］.我們課題組前期從紅樹林植物中分離得到一株內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp.LC18，通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其基因組中含有與安莎霉素合成相關(guān)的3－氨基－5－羥基苯甲酸（AHBA）合酶基因，具有產(chǎn)生安莎霉素類化合物的潛力.因此，本文對(duì)Streptomyces sp.LC18的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎的安莎霉素類化合物.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

Streptomyces sp.LC18分離自紅樹林植物秋茄中的內(nèi)生鏈霉菌，由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物藥物實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

燕麥培養(yǎng)基（ISP3）：燕麥20g，微量元素液1mL，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL，pH 7.2.（微量元素溶液：Fe2SO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，蒸餾水100mL）.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0.

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000mL.

1.1.3 試 劑

DMEM 購(gòu)自Gibco BRL公司；二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自華美公司；順鉑（cisplatin）購(gòu)自錦州制藥一廠；常用有機(jī)溶劑如甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚、正丁醇等均為分析純，購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司.

1.1.4 儀 器

Bruker Advance 600型核磁共振波譜儀（Bruker公司），API4000 型 質(zhì) 譜 儀 （Applied Biosystems公司），凝膠柱Sephadex LH－20（GE Healthcare公司），反相硅膠Silica gel 60RP－18（Merck公司），柱色譜用硅膠（200～300目）和薄層色譜用硅膠GF254（青島海洋化工廠）.

1.2 方 法

1.2.1 發(fā) 酵

從內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp.LC18保種斜面上刮取孢子接種ISP3固體培養(yǎng)基平板上，28℃活化培養(yǎng)5d.從活化的種子板上刮取孢子接種于ISP3發(fā)酵平板，每平板約25mL，共發(fā)酵10L，28℃倒置培養(yǎng)12d.

1.2.2 提取與分離

收集發(fā)酵12d的培養(yǎng)物，將其切成小塊，用V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（乙酸）＝80∶15∶5混合溶劑浸提3次，提取液減壓濃縮至干，然后用等體積的石油醚和甲醇（加5%的水）萃取3次.甲醇萃取液減壓濃縮至干，得浸膏4.2g.浸膏用少量甲醇溶解，經(jīng)凝膠柱（Sephadex LH－20，140g）色譜，甲醇洗脫合并后得到2個(gè)組分：Fr.1（1.880 1g）和Fr.2（139.4mg）.Fr.1（1.880 1g）經(jīng)反相中壓液相柱 （RP－18，30g）色譜，分別用體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、100%甲醇洗脫，合并后得到2個(gè)組分：Fr.1.a（155.2mg）和Fr.1.b（436.6mg）.Fr.1.a（155.2mg）經(jīng)正相硅膠柱分離，石油醚－乙酸乙酯 （1∶1）洗脫，得到化合物2（56.2mg）.Fr.1.b（436.6mg）經(jīng)正相硅膠柱分離，石油醚－丙酮 （5∶1）洗脫，得到化合物1（263.3mg）.Fr.2（139.4mg）經(jīng)反相中壓液相柱 （RP－18，30g）色譜，60%甲醇洗脫，得到化合物3（11.9mg）.

1.2.3 抗菌和細(xì)胞毒活性測(cè)定

化合物的抗菌活性檢測(cè)采用紙片擴(kuò)散法，以橙色青霉菌 （Penicilium avellaneum，編號(hào) UC－4376）、水稻稻瘟菌 （Magnaporthe grisea，實(shí)驗(yàn)室保存）和枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis，ATCC，編號(hào)11060）作為指示菌株，利福霉素為陽(yáng)性藥物，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)取平均值.細(xì)胞毒活性采用 MTT法［10］，檢測(cè)化合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株 MDA－MB－231、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3的抑制作用，陽(yáng)性對(duì)照藥物為順鉑.實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，取平均值繪制抑制曲線，計(jì)算IC50值.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

通過(guò)各種柱層析分離，從10L固體發(fā)酵提取物中分離得到3個(gè)安莎霉素類化合物，根據(jù)核磁共振以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定了化合物1～3的結(jié)構(gòu)（圖1），分別為herbimycin A （1），herbimycin C （2），hygrocin A derivative 6（3）.

化合物1：黃色粉末.ESI－MS m／z：575.4 ［M＋H］＋，597.5［M＋Na］＋.1H－NMR（600MHz，CDCl3）δ：8.82（1H，s，—NH），2.03（3H，s，H－2a），6.98（1H，m，H－3），6.51（1H，t，J＝12Hz，H－4），5.89（1H，m，H－5），4.13（1H，d，J＝12Hz，H－6），3.32（3H，s，6－OCH3），5.31（1H，s，H－7），4.52（2H，br.s，7－OCONH2），1.76（3H，br.s，H－8a），5.77（1H，m，H－9），2.65（1H，m，H－10），1.11（3H，d，J＝6.0Hz，H－10a），3.40（1H，m，H－11），3.29（3H，s，11－OCH3），3.54（1H，m，H－12），3.26（3H，s，12－OCH3），1.92（2H，m，H－13），1.68（1H，m，H－14），0.82（3H，d，J＝6.0Hz，H－14a），4.37（1H，m，H－15），3.35（3H，s，15－OCH3），6.64（1H，m，H－17），7.35（1H，s，H－19）.13CNMR（150MHz，CDCl3）δ：168.9（C－1），134.6（C－2），12.5（C－2a），128.1（C－3），125.8（C－4），136.8（C－5），78.2（C－6），55.8（6－OCH3），79.2（C－7），155.7（7－OCONH2），131.5（C－8），14.2（C－8a），130.9（C－9），34.3（C－10），16.5（C－10a），82.3（C－11），58.5（11－OCH3），83.7（C－12），57.8（12－OCH3），33.8（C－13），36.4（C－14），13.5（C－14a），78.7（C－15），59.7（15－OCH3），144.7（C－16），132.7（C－17），187.7（C－18），113.2（C－19），138.3（C－20），184.1（C－21）.上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的化合物herbimycin A一致.

化合物2：淡黃色粉末.ESI－MS m／z：561.1［M＋H］＋，583.0［M＋Na］＋.1H－NMR（600MHz，CDCl3）δ：8.59（1H，s，—NH），2.05（3H，s，H－2a），6.96（1H，m，H－3），6.59（1H，t，J＝12.0Hz，H－4），5.88（1H，t，J＝6.0Hz，H－5），4.35（1H，d，J＝12.0Hz，H－6），3.35（3H，s，6－OCH3），5.28（1H，s，H－7），4.93（2H，br s，7－OCONH2），1.80（3H，s，H－8a），5.82（1H，m，H－9），2.79（1H，m，H－10），1.04（3H，d，J＝6.0Hz，H－10a），3.46（1H，m，H－11），3.57（1H，m，H－12），3.30（3H，s，12－OCH3），1.94（2H，m，H－13），1.70（1H，m，H－14），0.88（3H，d，J＝6.0Hz，H－14a），4.37（1H，m，H－15），3.38（3H，s，15－OCH3），6.64（1H，s，H－17），7.50（1H，d，J＝6.0Hz，H－19）.上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的化合物herbimycin C一致.

化合物3：墨綠色粉末.ESI－MS m／z：510.5［M＋H］＋，532.4 ［M ＋ Na］＋.1H－NMR （600MHz，CD3OD）δ：3.87（1H，d，J＝15.5Hz，H－2），6.47（1H，d，J＝9.6Hz，H－3），2.21（3H，s，H－4a），4.81（1H，m，H－6），0.97（3H，d，J＝6.4Hz，H－6a），3.98（1H，s，H－7），4.24（1H，d，J＝10.8Hz，H－8），5.23（1H，ddd，J＝2.0，9.7，15.5Hz，H－9），1.54（1H，m，H－10），1.76（1H，m，H－10a），1.08（1H，m，H－10a），0.74（3H，t，J＝7.3Hz，H－10b），1.35（2H，m，H－11），2.66（1H，m，H－12），2.50（1H，m，H－12），2.31（3H，s，H－16a），7.56（1H，s，H－17），5.82（1H，s，H－21）.13C－NMR（150MHz，CD3OD）δ：175.5（C－1），54.5（C－2），131.3（C－3），33.9（C－4），20.1（C－4a），167.0（C－5），74.7（C－6），12.3（C－6a），70.4（C－7），126.6（C－8），136.3（C－9），42.7（C－10），28.2（C－10a），11.3（C－10b），33.5（C－11），41.3（C－12），210.6（C－13），127.1（C－14），151.7（C－15），131.7（C－16），15.6（C－16a），129.0（C－17），132.9（C－18），72.3（C－19），163.0（C－20），102.1（C－21），184.0（C－22），127.9（C－23）.上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的化合物hygrocin A derivative 6一致.

2.2 化合物的抗菌和細(xì)胞毒活性

用紙片擴(kuò)散法測(cè)定安莎霉素類化合物1～3（載藥量均為50μg）的抑菌活性（圖2）.化合物1和2對(duì)橙色青霉菌抑菌圈直徑分別為（30.66±1.53）和（9.33±1.15）mm，對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑分別為（7.67±0.58）和（11.67±0.58）mm；化合物1對(duì)水稻稻瘟菌抑菌圈直徑為（11.67±1.53）mm；化合物3對(duì)供試菌株沒有抑菌活性.

用MTT法檢測(cè)安莎霉素類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，結(jié)果顯示3個(gè)化合物均能抑制腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)，其IC50值見表1.

圖1 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1－3

圖2 安莎霉素類化合物1～3的抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of ansamycin compounds 1－3

表1 安莎霉素類化合物1～3對(duì)MDA－MB－231和PC3細(xì)胞的增殖抑制Tab.1 Growth－inhibitory effects of ansamycin compounds 1－3 on MDA－MB－231and PC3cells

3 討 論

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是藥物開發(fā)的重要來(lái)源，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期和廣泛的研究，從土壤微生物中發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物日益困難，研究學(xué)者們逐步將注意力轉(zhuǎn)向特殊生境的微生 物［14］.Strobel等［15］從 短 葉 紅 豆 杉 （Taxus brevifolia）中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreana，證明內(nèi)生菌具有合成宿主代謝產(chǎn)物的能力，開辟了從內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)活性代謝產(chǎn)物藥物的新途徑.基于“內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期系統(tǒng)演化中形成了互惠共生關(guān)系，在協(xié)同進(jìn)化中發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生與宿主相似或相同的生物活性物質(zhì)”的假說(shuō)，植物內(nèi)生菌及其產(chǎn)生活性成分的研究受到廣泛關(guān)注［16］.

本文從紅樹林植物來(lái)源內(nèi)生菌Streptomyces sp.LC18中分離得到2種類型3個(gè)安莎霉素類化合物，其中herbimycin A（1）和herbimycin C（2）為8酮苯安莎霉素，最初是從土壤吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中分離得到，能選擇性殺死雙子葉植物，具有除草活性［11－12］.化合物3為9酮萘安莎霉素，也是從吸水鏈霉菌中分離得到的安莎化合物［13］.化合物1～3雖然均為已知化合物，但這是從植物內(nèi)生菌中分離得到的2種類型的安莎霉素，表明植物內(nèi)生菌也是發(fā)現(xiàn)安莎霉素的重要來(lái)源，具有產(chǎn)生多種類型安莎化合物的豐富性.生物活性測(cè)定顯示，化合物1對(duì)細(xì)菌和真菌均具有較好的抑菌活性，對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞株IC50小于1μmol／L，具有顯著的細(xì)胞毒活性.文獻(xiàn)［17］報(bào)道，化合物1可以結(jié)合Hsp90，是酪氨酸激酶的選擇性抑制劑，其細(xì)胞毒活性可能與此相關(guān).化合物2在抑菌和細(xì)胞毒活性上較弱，可能與其結(jié)構(gòu)中C－11位甲氧基被羥基取代有關(guān)，降低了生物活性，與文獻(xiàn)［12］中結(jié)果一致.化合物3對(duì)供試菌株沒有抑菌活性，但能顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞和前列腺癌PC3細(xì)胞IC50值分別是0.5和1.9μmol／L，其作用機(jī)制尚不清楚，可能是潛在的新型抗腫瘤藥物，值得進(jìn)一步深入研究.

［1］Lounis N，Roscigno G.In vitro and in vivo activities of new rifamycin derivatives against mycobacterial infections［J］.Curr Pharm Des，2004，10（26）：3229－3238.

［2］Campbell E A，Korzheva N，Mustaev A，et al.Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase［J］.Cell，2001，104（6）：901－912.

［3］Ikeda H，Hideshima T，F(xiàn)ulciniti M，et al.The monoclonal antibody nBT062conjugated to cytotoxic maytansinoids has selective cytotoxicity against CD138－positive multiple myeloma cells in vitro and in vivo［J］.Clin Cancer Res，2009，15（12）：4028－4037.

［4］Cassady J M，Chan K K，F(xiàn)loss H G，et al.Recent developments in the maytansinoid antitumor agents［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2004，52（1）：1－26.

［5］Franke J，Eichner S，Zeilinger C，et al.Targeting heatshock－protein 90 （Hsp90）by natural products：geldanamycin，a show case in cancer therapy［J］.Nat Prod Rep，2013，30（10）：1299－1323.

［6］August P R，Tang L，Yoon Y J，et al.Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin：deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699［J］.Chem Biol，1998，5（2）：69－79.

［7］Wang H X，Chen Y Y，Ge L，et al.PCR screening reveals considerable unexploited biosynthetic potential of ansamycins and a mysterious family of AHBA－containing natural products in actinomycetes［J］.J Appl Microbiol，2013，115（1）：77－85.

［8］Yu T W，Bai L，Clade D，et al.The biosynthetic gene cluster of the maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（12）：7968－7973.

［9］Hong K，Gao A H，Xie Q Y，et al.Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soils and plants in China［J］.Mar Drugs，2009，7（1）：24－44.

［10］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65（1／2）：55－63.

［11］Omura S，Iwai Y，Takahashi Y，et al.Herbimycin，a new antibiotic produced by a strain of Streptomyces［J］.J Antibiot（Tokyo），1979，32（4）：255－261.

［12］Shibata K，Satsumabayashi S，Nakagawa A，et al.The structure and cytocidal activity of herbimycin C［J］.J Antibiot（Tokyo），1986，39（11）：1630－1633.

［13］Cai P，Kong F，Ruppen M E，et al.Hygrocins A and B，naphthoquinone macrolides from Streptomyces hygroscopicus［J］.J Nat Prod，2005，68（12）：1736－1742.

［14］Tiwari K，Gupta R K.Rare actinomycetes：apotential storehouse for novel antibiotics［J］.Crit Rev Biotechnol，2012，32（2）：108－132.

［15］Stierle A，Strobel G，Stierle D.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew［J］.Science，1993，260（5105）：214－216.

［16］Li Y，Shen Y.Chemical components of some microorganisms isolated from specific habitats and their antitumor activities［J］.Chin J Org Chem，2013，33（6）：1135－1143.

［17］Sakagami M，Morrison P，Welch W J.Benzoquinoid ansamycins （herbimycin A and geldanamycin）interfere with the maturation of growth factor receptor tyrosine kinases［J］.Cell Stress Chaperones，1999，4（1）：19－28.