大黃上清液聯(lián)合母乳對Caco-2炎癥細胞Toll樣受體表達的影響*

馮偉偉 阮為勇 步偉全

（江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028）

新生兒學在近年取得了很大進步，但仍有許多相關疾病的發(fā)病機制尚未完全清楚。新生兒壞死性小腸結腸炎（NEC）就是其中之一。大量的臨床及實驗研究證實應用大黃及母乳喂養(yǎng)防治NEC有良好的前景。Lucas A等［1］通過臨床研究證實，單純母乳喂養(yǎng)新生兒的NEC的發(fā)病率較人工喂養(yǎng)新生兒明顯偏低。相關中醫(yī)的臨床及實驗也證實，生大黃在防治NEC方面顯示了較好的臨床效果，且應用前景廣泛［2-3］。近年來的研究認為：NEC的發(fā)病機制可能與Toll樣受體（TLR）、脂多糖 （LPS）及NF-κB信號傳導的異常激活有密切關聯(lián)。TLR4是目前研究較多的Toll樣受體之一，TLR4的相關作用機制為：識別脂多糖（LPS）并介導其跨膜信號轉導，進而激活炎癥因子，受LPS活化后的TLR4進一步啟動相關腸道黏膜細胞的炎癥反應，該機制已被證實與包括NEC在內的許多感染性疾病密切相關［4-8］。母乳防治NEC有顯著的療效，母乳中含有免疫球蛋白、乳鐵蛋白、淋巴細胞、巨噬細胞、溶菌酶等多種免疫調節(jié)因子，以及表皮生長因子、雙歧因子、核酸等多種生物活性物質，上述因子能夠顯著改善胃腸道的免疫防御功能，使其免受致病菌侵犯并減輕炎癥損傷；大黃可“蕩滌胃腸、推陳致新、調中化食，安和五臟”［9］，其主要作用部位在腸道，能夠促進胃腸道蠕動、保護黏膜屏障，同時有清除腸道內細菌和內毒素、預防腸道細菌易位、改善微循環(huán)、促進胃腸道新陳代謝、調節(jié)免疫等功效。目前尚未見有關大黃及母乳對NEC腸道炎癥細胞Toll樣受體表達影響的報道。本課題擬探討在大黃上清液及母乳的干預下Caco-2炎癥細胞Toll樣受體表達的變化，進一步揭示防治NEC的具體作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 母乳及大黃有效成分的提取 （1）母乳上清液的提取：母乳來自于江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院婦產科產婦6例，每位產婦均產出1名足月兒且無妊娠期并發(fā)癥。生后2～4 d的母乳存于4℃冰箱，在24 h內處理，12000 r/min離心10min去除脂肪成分和細胞碎片，保留乳清用于實驗，然后存于-20℃冰箱備用。（2）大黃上清液的提?。航K省中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房提供生大黃粉1 g加入磷酸鹽緩沖液 （PBS）5 mL攪拌混勻，靜置10min后取其上清液為淡黃色母液，分別配制為0.1%、1%、2.5%3個不同的大黃濃度。

1.2 細胞與試劑 Caco-2細胞株（購自中科院上海細胞 庫 ）；Dual-luciferase reporter assay system （promega usa）；人外周血紅細胞裂解液（中國深圳晶美生物工程有限公司）；無水丙酮（中國長沙麗欣生物工程有限公司）；多聚賴氨酸（中國長沙麗欣生物工程有限公司）；逆轉錄試劑盒 （美國MBI Fermentas公司）；PCR試劑盒（美國MBI Fermentas公司）；Tr1201試劑（美國Ivitrogen公司）；DNA Marker DL 2000（中國大連寶生物技術有限公司）；瓊脂糖（BBI公司，由中國上海生物工程技術服務有限公司分裝）；Tris堿、0.5×TBE電極緩沖液、硼酸等試劑為國家分析純產品（中國上海生物工程技術服務有限公司）；PCR引物（中國上海生物工程技術服務有限公司）：GAPDH 引物 F：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH 引物 R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3 主要儀器 5415R高速臺式離心機（Germany，Eppendorf）；7500 熒光定量 PCR 儀（USA，ABI）；CentroX3超靈敏微孔板發(fā)光檢測儀（Germany，BERTHOLD）；Mini Trans-Blot轉移電泳槽、Mini ProteanⅢ蛋白垂直電泳槽、PowerPac 200/HC/3000電泳儀、Mini-Sub Cell GT 水平電泳槽 （USA，BIO-RAD）；EDC-810 PCR儀（中國，東勝）；311/3141細胞培養(yǎng)箱（USA，ThermoFisher），d-63450 生物安全柜（Germany，Heal Force）；凝膠成像儀（England，Syngene）；ND-1000核酸蛋白測定儀 （USA，Nano Drop）；ELx 808酶標儀（USA，BIO-TEK）。

1.4 Caco-2細胞培養(yǎng) Caco-2細胞適宜在37℃、5%CO2和90%相對濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，采用DMEM培養(yǎng)基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液。細胞培養(yǎng)在75 cm2培養(yǎng)瓶中，每5日按1∶3的比例傳代，傳代后6～7 d細胞生長達到融合。

1.5 炎癥細胞模型分組 （1）對照組：檢測正常Caco-2細胞中Toll樣受體mRNA表達。（2）TNF-α誘導組：向TNF-α誘導的Caco-2炎癥細胞中同時加入常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測Caco-2細胞中Toll樣受體mRNA 表達量。（3）TNF-α+1%大黃組：向 TNF-α 誘導的Caco-2細胞中加入1%大黃上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測Caco-2細胞中Toll樣受體mRNA表達量。（4）TNF-α+1%母乳組：向TNF-α誘導的Caco-2細胞中加入1%母乳上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測Caco-2細胞中Toll樣受體mRNA表達量。（5）TNF-α+1%大黃+1%母乳組：向TNF-α誘導的Caco-2細胞中同時加入1%大黃上清液和1%母乳上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測Caco-2細胞中Toll樣受體mRNA表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，以P＜0.01為有顯著意義。

2 結 果

各組實驗細胞中Toll樣受體mRNA的相對表達量見表1。由實驗結果表明，1%的大黃上清液、1%母乳及兩者聯(lián)合聯(lián)合均可降低Caco-2炎癥細胞TLR4 mRNA的表達，與TNF-α誘導組比較均有顯著差異（P＜0.01）；1%大黃聯(lián)合1%母乳干預較1%大黃干預作用明顯，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；1%大黃聯(lián)合1%母乳干預較單用1%母乳干預作用明顯（P＜0.05）；1%母乳干預較1%大黃干預作用明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組TLR4 mRNA的表達（）

表1 各組TLR4 mRNA的表達（）

與TNF-α誘導組比較，*P＜0.01；與TNF-α+1%大黃+1%母乳組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 討 論

NEC是新生兒尤其是早產兒常見的消化道危急重癥，新生兒重癥監(jiān)護病房中NEC的發(fā)生率為1%～5%，而在極低出生體重兒中發(fā)生率高達5%～10%。NEC的死亡率可高達32%，近年來隨著小兒外科和重癥醫(yī)學的進步，NEC病死率已下降到20%左右，NEC在NICU中的高發(fā)生率和死亡率對早產兒預后產生重要的影響［10］。治療方面，近年來，有報道應用大黃及母乳防止NEC取得了良好的臨床療效。關于兩者防治NEC的具體作用機制罕見報道，本實驗體外培養(yǎng)了與人腸上皮細胞生物學功能相似的人結腸腺癌細胞系，并用TNF-α刺激該細胞，以模擬腸道的炎癥反應，探討炎癥狀態(tài)時腸上皮細胞的生物學功能。對于本病的發(fā)病機制，研究表明可能與TLR、NF-κB信號傳導的異常激活及LPS相關。

本課題主要研究指標之一TLR4，主要識別LPS等炎癥介質并介導其跨膜信號轉導激活炎癥因子，TLR4在受LPS活化后，將啟動一系列腸道黏膜細胞的炎癥反應，這已被證實與包括NEC在內的多種感染性疾病密切相關［4］。Toll樣受體是一種免疫受體，具有跨膜信號轉導功能，能夠識別存在于病原體細胞表面的分子標志，并與其結合產生信號轉導，最終觸發(fā)炎癥反應［5-6］。TLR4是Toll樣受體中研究較為深入的，其能識別相關細胞因子并結合成復合物，進一步將此信號轉入細胞內，最終激活核轉錄因子NF-κB，NF-κB作為促炎癥基因表達的樞紐之一［4］，在靜息狀態(tài)下κB抑制蛋白（IkB）和NF-κB結合在一起存在于胞質中，當細胞受到缺氧、感染及炎性細胞因子等刺激后，IκB激酶發(fā)生降解，繼而NF-κB進入細胞核內發(fā)揮其基因調控作用，NF-κB 活化后可增強 TNF-κB、IL-6 等炎癥因子基因的信號表達，上調炎癥反應使TNF-α、IL-6等炎癥因子產生釋放增多；然而TNF-α、IL-6等炎癥因子又可以進一步激活NF-κB，導致最初的炎癥信號進一步放大，造成過度的炎癥反應。

本研究結果顯示，1%大黃上清液、1%母乳上清液、1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液對Caco-2炎癥細胞Toll樣受體mRNA的相對表達量均有明顯抑制作用，相對于加入常規(guī)培養(yǎng)液的TNF-α誘導組（均P＜0.01），差異有顯著統(tǒng)計學意義。1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液組較1%大黃上清液組效果更明顯（P＜0.01），兩組差異有顯著統(tǒng)計學意義；1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清組較1%母乳上清液組作用強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1%母乳上清液組較1%大黃上清液組作用強，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

本試驗結果可以證明，經TNF-α刺激后，Caco-2細胞中高表達TLR4。分別予以大黃上清液、母乳及兩者聯(lián)合干預炎癥細胞模型后，Toll樣受體mRNA的表達量有不同程度下降，說明Toll樣受體參與了NEC的發(fā)病過程，且說明1%大黃上清液、1%母乳上清液、1%大黃上清液聯(lián)合1%母乳上清液可降低Caco-2炎癥細胞Toll樣受體mRNA的過度表達，從而起到延緩NEC進展的作用。

［1］Lucas A，Cole TJ.Breast milk and neonatal necrotising enterocolitis［J］.Lancet，1990，336：1519-1523.

［2］周于新，沈迎春，張雙船，等.生大黃防治新生鼠缺氧腸黏膜損傷作用的機制［J］.實用兒科臨床雜志，2007，22（2）：142.

［3］陳德昌，楊興易，景炳文，等.大黃對危重癥患者應激性胃腸粘膜病變的治療作用及其機制的研究［J］.中國危重病急救醫(yī)學，1996，8（7）：395.

［4］Cynthia L，Leaphart，Jaime Cavallo，et al.Acritical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair ［J］.J Immunol，2007，179（7）：4808.

［5］張金萍，陳超，楊毅，等.Toll樣受體2和4在新生兒感染時的變化及其臨床意義［J］.中華兒科雜志， 2007， 45（2）：130-133.

［6］Medzhitov R，Janeway C.The Toll receptor family and microbial recognition［J］.Trends Microbio，2000，8（10）：452-456.

［7］Beutler B.Inferences，questions and possibilities in Toll-like receptor signaling［J］.Nature，2004，430（6996）：257-263.

［8］Medzhitov R，Preston-Hurlburt P，Janeway CA.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388（6640）：394-397.

［9］牟宜坤，李瑪琳，楊為民，等.大黃對胃腸道作用及其機制探討［J］.醫(yī)學綜述，2003，9（2）：125-126.

［10］陳超.新生兒壞死性小腸結腸炎的熱點問題［J］.中國循證兒科雜志，2011，6（5）：321.