筋脈通膠囊通過增強背根神經(jīng)節(jié)Nrf2和HO-1的表達改善糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛

吳群勵，張 宏，樸元林，屈 嶺，孫連慶，王普艷，石 玥，高云周，梁曉春*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心， 北京 100730；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 2.細(xì)胞中心；3.病理中心， 北京 100005)

研究論文

筋脈通膠囊通過增強背根神經(jīng)節(jié)Nrf2和HO-1的表達改善糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛

吳群勵1，張 宏2，樸元林1，屈 嶺1，孫連慶1，王普艷1，石 玥1，高云周3，梁曉春1*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心， 北京 100730；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 2.細(xì)胞中心；3.病理中心， 北京 100005)

目的觀察中藥筋脈通膠囊對鏈尿佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達以及血漿一氧化碳(CO)含量的影響。方法腹腔內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)建立DM大鼠模型，隨機分為模型組、筋脈通小、中和大劑量組及硫辛酸組，并設(shè)對照組。成模后每天1次灌胃給藥，持續(xù)12周。電子Von Frey儀檢測機械痛閾值，免疫組化法及Rt-PCR檢測DRG的Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達，并檢測血漿一氧化碳血紅蛋白(COHb)含量。結(jié)果與對照組相比，糖尿病大鼠的機械痛閾值、血漿COHb含量以及DRG的Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達水平均明顯下降(Plt;0.01)；各治療組的上述指標(biāo)均顯著回升(Plt;0.01或Plt;0.05)。在提高DRG的HO-1蛋白表達上，筋脈通中劑量組療效顯著優(yōu)于硫辛酸組(Plt;0.05)。結(jié)論筋脈通膠囊可通過增強DRG的Nrf2、HO-1和CO表達來改善糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛。

糖尿病周圍神經(jīng)病變；核因子E2相關(guān)因子2；血紅素加氧酶-1；一氧化碳；筋脈通

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)的發(fā)病率高達50%以上，而50%以上的DPN患者具有疼痛癥狀，極大影響生活質(zhì)量[1]。目前有關(guān)糖尿病神經(jīng)痛的確切病理生理機制尚未清楚。研究證實高血糖與神經(jīng)缺血可引起氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的活性氧和活性氮，損害線粒體，損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，破壞細(xì)胞的正常功能和完整性，造成軸突變性和死亡以及神經(jīng)纖維的功能減退、損害和缺失，與DPN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)為細(xì)胞防御多種應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子，是誘導(dǎo)Ⅱ相酶基因表達的必需調(diào)節(jié)因子。Ⅱ相酶中的血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)及其降解產(chǎn)物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促血管生成等多重生物活性，被認(rèn)為是體內(nèi)的天然防御系統(tǒng)。大量研究表明Nrf2/HO-1/CO系統(tǒng)的激活，可改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗，糾正高糖導(dǎo)致的組織細(xì)胞生化機能紊亂，延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[2-5]。臨床證實中藥筋脈通膠囊可有效改善糖尿病患者的疼痛癥狀[6-7]。本研究觀察了筋脈通膠囊對STZ-DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的Nrf2和HO-1的表達以及血漿CO含量等的影響，進一步探討其防治DPN的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～280 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SXCK(京)2007-0001]。

1.1.2 主要藥物和試劑：筋脈通膠囊(JMT)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑(北京九龍制藥廠加工生產(chǎn),每粒含生藥0.35 g)。硫辛酸膠囊(山東齊都藥業(yè)有限公司，0.3 g/粒)，精蛋白鋅胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司,400 U/10 mL)。STZ、兔抗鼠Nrf2和HO-1多克隆抗體(Sigma公司)，超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、RealSuper Mixture(with Rox)、DNase 1及Nrf2、HO-1引物設(shè)計(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組給藥：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，常規(guī)復(fù)制DM模型。根據(jù)隨機數(shù)字表將DM大鼠分為5組:模型(Model)組和筋脈通小、中、大劑量組(分別為JMT-L、JMT-M和JMT-H,按成人劑量的5、10和20倍給藥)及硫辛酸組(TAC, 按成人劑量的10倍給藥)，每組各10只。以體質(zhì)量、鼠齡相匹配的正常大鼠10只作為對照(conrol)組。DM大鼠每天皮下注射精蛋白鋅胰島素注射液1～4 U，維持血糖在20～25 mmol/L，防止因血糖過高無法存活至實驗終點。成模后即開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)12周。模型組和對照組灌服蒸餾水10 mL/(kg·d)。

1.2.2 檢測血糖及體質(zhì)量：于灌胃前及灌胃不同時間稱重并用羅氏血糖儀測定尾尖血血糖。

1.2.3 檢測機械痛閾值：在安靜環(huán)境中，將大鼠單獨置入多孔鋼絲籠中。待大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min后，以電子von Frey刺激針刺激大鼠后肢足底中部，力度由小到大逐漸增加，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)時，記錄von Frey電子記錄儀上顯示的壓力數(shù)值。每只大鼠刺激3次，間隔時間大于30 s，取平均值作為大鼠的機械痛閾值。

1.2.4 檢測血漿COHb含量：腹腔注射12%烏拉坦(10 mL/kg)麻醉大鼠，取頸動脈血用生化法測定血漿CO水平[8]。在420和432 nm兩個波長測定吸光度值，依比爾定律建立方程式，求出COHb的百分含量(代表內(nèi)源性CO水平)。

1.2.5 免疫組化法檢測背根神經(jīng)節(jié)Nrf2和HO-1蛋白的表達：心臟灌注4% 多聚甲醛約40 min，取與坐骨神經(jīng)相關(guān)的雙側(cè)第4、5和6背根神經(jīng)節(jié)，常規(guī)制片，按試劑盒說明書操作，檢測Nrf2和HO-1的表達。鏡檢呈棕黃色者為陽性表達。Leica DM3000顯微鏡及其圖像采集系統(tǒng)采集圖片，Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件分析圖片。每組隨機取5只大鼠，每只大鼠觀察2張切片，每張切片在200倍光鏡下選取5個互不重疊視野，測量積分吸光度(IA) 值，取均值作為1只大鼠的結(jié)果。

1.2.6 熒光定量PCR檢測背根神經(jīng)節(jié)Nrf2和HO-1的mRNA表達：迅速取下背根神經(jīng)節(jié)，置于-80℃液氮保存。按照說明書用超純RNA提取試劑盒提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳示28 s、18 s和5 s條帶清晰，紫外分光光度計檢測A260/280比值為1.8～2.0。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA用AB7500型熒光定量PCR儀進行PCR循環(huán)，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。每組隨機取5只大鼠，每份樣品均做3個復(fù)孔，另加3個無模板的陰性對照，取均值作為1只大鼠的檢測結(jié)果。引物序列為: Nrf2上游5′-GGACCTAAAGCA CAGCCAACACAT-3′，下游5′- TCGGCTTGAATGTTT GTCTTTTGTG-3′，擴增片段177 bp；HO-1上游5′-CT TTTTTCACCTTCCCGAGCATC-3′,下游5′-GGTCTTA GCCTCTTCTGTCACCCTGT-3′，擴增片段122 bp；內(nèi)參照GAPDH上游5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′,下游5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′，擴增片段138 bp。反應(yīng)體系為20 μL:cDNA 2 μL，引物上下游各0.4 μL，REALSYBR Mixture(×2)10 μL，水7.2 μL。擴增程序為：95 ℃ 10 min，(95 ℃15 s，60 ℃ 60 s)×40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血糖和體質(zhì)量的變化

對照組大鼠一般情況良好；模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食和多尿，精神萎靡，活動減少和白內(nèi)障；各治療組大鼠皆有類似模型組的表現(xiàn)，但程度較輕。模型組血糖顯著升高而體質(zhì)量顯著下降(Plt;0.01)，各治療組未能緩解上述變化。

2.2筋脈通膠囊能提高糖尿病大鼠的機械痛閾值和血漿CO水平

模型組DM大鼠的機械痛閾值和血漿CO水平較對照組明顯降低(Plt;0.01)，各治療組的機械痛閾值和血漿CO水平顯著回升(Plt;0.01)，但仍低于對照組(Plt;0.01)；JMT-M組的機械痛閾值較JMT-H組回升更高(Plt;0.05)(表1)。

表1 各組大鼠機械痛閾值和血漿COHb含量的比較

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.01 compared with model；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

2.3筋脈通膠囊能提高糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)Nrf2蛋白及其mRNA的表達水平

模型組背根神經(jīng)節(jié)Nrf2的IA值較對照組顯著降低(Plt;0.01)；各治療組的IA值顯著回升(Plt;0.01)；與TAC組相比，JMT各劑量組的IA值顯著增加(Plt;0.01或Plt;0.05)，其中JMT-M組高于JMT-L和JMT-H組(Plt;0.05)。模型組背根神經(jīng)節(jié)Nrf2的mRNA表達水平均較對照組顯著下降(Plt;0.01)；各治療組顯著回升(Plt;0.01)(表2，圖1)。

2.4筋脈通膠囊能提高糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)HO-1蛋白及其mRNA的表達水平

模型組背根神經(jīng)節(jié)HO-1蛋白及其mRNA表達水平較對照組明顯降低(Plt;0.01)；各治療組顯著回升(Plt;0.01或Plt;0.05)，其中JMT-M組HO-1的IA值高于TAC組和JMT-H組(Plt;0.05)(表3，圖2)。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)Nrf2蛋白及其mRNA表達結(jié)果的比較

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.01 compared with model；▲Plt;0.05，▲▲Plt;0.01 compared with TAC；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)HO-1蛋白及其mRNA表達結(jié)果的比較

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05，##Plt;0.01 compared with model；△Plt;0.05 compared with JMT-M.

圖1 大鼠各組DRG的Nrf2免疫組化表達Fig 1 Immunohistochemical expression of Nrf2 in different group rats’ DRG(×20)

3 討論

疼痛是DPN患者最常見、最突出的癥狀和首要就診原因[1]。本研究結(jié)果顯示STZ誘導(dǎo)后12周，糖尿病大鼠的機械痛閾值較正常大鼠明顯降低，提示SD大鼠存在疼痛超敏，DPN造模成功。眾所周知DPN的發(fā)病機制十分復(fù)雜的，是多重致病因素共同作用的結(jié)果。其中神經(jīng)氧化應(yīng)激因與代謝途徑的多元醇通路、己糖胺通路、PKC通路、AGEs通路和PARP通路等相互影響，認(rèn)為是DPN神經(jīng)血管功能障礙的中心病理機制?？寡趸瘧?yīng)激治療是防治DPN的有效途徑之一[2-5]。

Nrf2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，以Keap1-Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化機制中的最重要通路。受到ROS或親核物質(zhì)刺激時，在激酶通路包括MAPK、PI3K和PCK等的參與下，Nrf2從Keap1上解藕聯(lián)，游離的Nrf2進入核內(nèi)，從而激活Nrf2信號通路，啟動下游抗氧化蛋白基因如Ⅱ相解毒酶、超氧化物歧化酶、抗氧化酶、谷胱甘肽合成代謝相關(guān)酶等的轉(zhuǎn)錄[2]。血紅素加氧酶屬于Ⅱ相解毒酶，是一種血紅素降解的起始酶和限速酶，催化血紅素在體內(nèi)氧化分解為膽綠素、CO和Fe2+，隨之膽綠素迅速還原成膽紅素，鐵離子誘導(dǎo)鐵蛋白的合成。人體內(nèi)有誘導(dǎo)型HO-1及組成型HO-2和HO-3這3 種HO同工酶。CO在細(xì)胞內(nèi)形成，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)后彌散入血，一部分由肺排出體外，另一部分則以COHb的形式存在，因此可以通過測定血中COHb濃度來間接反應(yīng)HO-1的活性[8]。許多研究表明，HO-1及其降解產(chǎn)物CO均具有細(xì)胞保護、抗氧化、抗凋亡、促血管生成和抗炎的作用[3-5]。

圖2 大鼠各組DRG的HO-1免疫組化表達Fig 1 Immunohistochemical expression of HO-1 in different group rats’ DRG(×20)

Nrf2及HO-1是防治DM及DPN等DM慢性并發(fā)癥的新靶點[2,5,9]。SD大鼠坐骨神經(jīng)的Nrf2及HO-1表達水平均較正常鼠明顯下降[2]。本研究結(jié)果顯示SD大鼠DRG的Nrf2、HO-1的蛋白及其mRNA表達水平以及血漿CO含量均較正常大鼠顯著下降，這與上述研究結(jié)果類似。有研究證實HO-1/CO通路的激活，可通過抗炎和抗氧化機制，減輕大鼠的外周神經(jīng)痛[10]；而Nrf2可通過上調(diào)HO-1的表達，減輕甲醛誘導(dǎo)的小鼠外周神經(jīng)炎性疼痛[11]。提示Nrf2/HO-1/CO表達水平的下降，是導(dǎo)致DPN外周神經(jīng)痛的可能病理機制。研究發(fā)現(xiàn)JSH-23(NF-κB抑制劑)能夠通過增加Nrf2與HO-1的表達，降低炎性反應(yīng)對坐骨神經(jīng)的損害，提高SD大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善其神經(jīng)血流缺陷和機械痛閾；褪黑素和蘿卜硫素能夠通過提高Nrf2與HO-1的表達，降低SD大鼠坐骨神經(jīng)異常增高的NF-κB和促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2)水平，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA斷裂[2]。目前尚未見中藥復(fù)方對DPN時Nrf2/HO-1系統(tǒng)影響的研究報道。

既往研究表明，筋脈通能明顯改善DPN患者的臨床癥狀、神經(jīng)體征和神經(jīng)傳導(dǎo)速度[6-7]；改善STZ-DM大鼠坐骨神經(jīng)的病理形態(tài)學(xué)異常，減少NF-κB的異常高表達[12]；其含藥血清可抑制高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的NF-κB及其mRNA的表達[13]。α硫辛酸具有抗氧化作用，能改善糖尿病周圍神經(jīng)病變的疼痛超敏狀態(tài)及神經(jīng)功能[14]，故本研究以硫辛酸膠囊作為陽性對照藥。研究顯示，小、中、大劑量的筋脈通膠囊同硫辛酸膠囊一樣，均能顯著升高SD大鼠的機械痛閾值，增加血漿COHb含量，上調(diào)DRG的Nrf2及HO-1的蛋白及其mRNA表達水平。在提高DRG的HO-1蛋白表達上，筋脈通中劑量組的療效顯著優(yōu)于硫辛酸組。表明筋脈通膠囊具有增強STZ-DM大鼠DRG的Nrf2、HO-1和CO表達的作用，且療效優(yōu)于硫辛酸。筋脈通中劑量組較大劑量組能顯著升高糖尿病大鼠的機械痛閾值、增強DRG的Nrf2和HO-1表達，表明筋脈通膠囊的3個劑量組中，中劑量組的療效最好。

綜上所述，本研究推測認(rèn)為STZ-DM大鼠的周圍神經(jīng)痛覺減低與其背根神經(jīng)節(jié)的Nrf2、HO-1和CO的表達降低有關(guān)；中藥筋脈通膠囊可通過增強背根神經(jīng)節(jié)的Nrf2、HO-1和CO的表達來改善其痛覺異常。有關(guān)Nrf2/HO-1/CO通路的具體調(diào)節(jié)機制以及它們對DM、DPN的影響迄今尚未完全闡明，故筋脈通究竟是如何上調(diào)DPN時異常降低的Nrf2/HO-1/CO活性，仍有待于今后進一步深入研究。

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Jinmaitong capsule can ameliorate the peripheral neuropathic pain of STZ-DM rats by enhancing the expressions of Nrf2 and HO-1 in DRG

WU Qun-li1, ZHANG Hong2, PIAO Yuan-lin1, QU Ling1, SUN Lian-qing1, WANG Pu-yan1, SHI Yue1,GAO Yun-zhou3, LIANG Xiao-chun1*

(1.Dept. of Traditional Chinese Medicine, PUMC Hospital Beijing 100730;2.Dept. of Cell Biology; 3.Dept. of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the effects of Jinmaitong Capsule (JMT) on the expression of nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) and haem oxygenase-1 (HO-1) and their mRNAs in dorsal root ganglion (DRG) and the level of plasma carbon monoxide (CO) in STZ-induced diabetic rats.MethodsSTZ-induced diabetic rats were randomly divided into 5 groups including model group, low-dose JMT group, middle-dose JMT group, high-dose JMT groupand Thioctic Acid Capsule (TAC) group. Ten normal rats matching with weight and age served as the control group. All rats were treated by intragastric administration for 12 weeks and then culled. The mechanical withdrawal threshold was tested by electronic Von Frey instrument before death. The expressions of Nrf2 and HO-1 and their mRNAs in DRG were detected by SABC immunohistochemical method and real-time fluorogenetic quantitative PCR

respectively. The content of plasma COHb was also measured.ResultsCompared with the control group, the mechanical withdrawal threshold, the content of plasma CO and the expressions of Nrf2 and HO-1 and their mRNAs in DRG of all the diabetic rats groups decreased significantly (Plt;0.01). All the above-mentioned indexes in treatment groups raised strikingly (Plt;0.05 orPlt;0.01). The middle-dose JMT group was more effective than the TAC group in enhancing the expression of HO-1 in DRG (Plt;0.05).ConclusionsJinmaitong Capsule can ameliorate the peripheral neuropathic pain of STZ-DM rats by enhancing the expressions of Nrf2, HO-1 and CO in DRG.

diabetic peripheral neuropathy; nuclear factor-E2-related factor 2; haem oxygenase-1; carbon monoxide; Jinmaitong capsule

2013-11-21

2013-12-13

國家自然科學(xué)基金(81001580)

*通信作者(correspondingauthor)： xcliang@vip.sina.com

1001-6325(2014)02-0179-06

R285.5

A