N-乙酰半胱氨酸減輕香煙煙霧提取物所致的A549細(xì)胞損傷

張強(qiáng)弩，焦宗憲，常嘉琛

(蘭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)研究所， 甘肅 蘭州 730000)

研究論文

N-乙酰半胱氨酸減輕香煙煙霧提取物所致的A549細(xì)胞損傷

張強(qiáng)弩，焦宗憲*，常嘉琛

(蘭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)研究所， 甘肅 蘭州 730000)

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)香煙煙霧提取物(CSE)暴露后的A549細(xì)胞的影響。方法MTT法測定不同處理后A549細(xì)胞的存活率；用PI單染和AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞的周期變化和凋亡變化；用熒光探針H2DCFDA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)變化；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot 技術(shù)檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)的表達(dá)變化。結(jié)果CSE致A549細(xì)胞存活的A值為0.55±0.04，顯著低于對(duì)照組的0.78±0.03(Plt;0.05)，NAC處理使A值顯著上升至0.67±0.04(Plt;0.05)，并消除了G1期阻滯，降低細(xì)胞凋亡率等。IGFBP-3的表達(dá)在CSE刺激后，有所升高，在接受NAC保護(hù)后，其表達(dá)水平有所降低(Plt;0.05)。結(jié)論NAC可以抑制香煙煙霧提取物造成的A549細(xì)胞損傷，IGFBP-3可能在香煙煙霧提取導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制中發(fā)揮作用。

IGFBP-3；香煙煙霧提取物；肺泡上皮細(xì)胞；N-乙酰半胱氨酸

香煙煙霧可以引發(fā)氧化應(yīng)激，對(duì)肺泡上皮細(xì)胞造成損傷[1],此過程涉及細(xì)胞增殖障礙但其具體機(jī)制尚未清楚[2]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[3]。高氧暴露后，IGFBP的表達(dá)發(fā)生變化[4]。氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷的機(jī)制也可能與IGFBP有關(guān)。IGFBP-3是IGFBP家族的重要的成員，故本研究用香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激，然后分析IGFBP-3表達(dá)水平的變化，以期找到兩者的聯(lián)系。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine，NAC)是一種效果明確的抗氧化劑[5]。但具體來講，NAC是否可以從細(xì)胞周期阻滯，降細(xì)胞凋亡等方面，改善CSE導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞損傷，還有待驗(yàn)證。因此本研究假設(shè)NAC可以從多角度對(duì)抗CSE來源的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷，同時(shí)會(huì)影響IGFBP-3在損傷中的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

A549細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)MTT試劑，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒和DCFH-DA熒光探針(Sigma公司)RIPA裂解液和BCA蛋白定量分析盒(北京普利萊生物技術(shù)公司)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體和小鼠抗人ACTB多克隆抗體(Abcam公司)RNAiso Plus Kit，PrimeScript? RTreagent Kit和SYBR? Premix EX TaqⅡ[寶生物工程(大連)有限公司)]。Dy-Light 800 紅外二抗(KPL實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將A549細(xì)胞置于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞消化采用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶。選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組，單純CSE處理組和CSE+NAC處理組，詳細(xì)分組如下所述，每組設(shè)5個(gè)平行樣本。

1.3 香煙煙霧提取物的制備

使用本研究組自行開發(fā)設(shè)計(jì)的CSE系統(tǒng)制備CSE，將3支香煙產(chǎn)生的主流煙霧溶于20 mL無血清DMEM培養(yǎng)基中，保證充分吸收。調(diào)整此溶液的pH至7.5，使用0.22 μm孔徑的濾器過濾除菌。設(shè)定此溶液為濃度100% CSE，在隨后實(shí)驗(yàn)中用DMEM培養(yǎng)基稀釋使用，保證該CSE在制備30 min內(nèi)使用。

1.4 MTT法分析細(xì)胞存活率

制備細(xì)胞懸液，以1.5×105/mL接種入96孔板，每孔150 μL。于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，無血清DMEM處理16 h。隨后細(xì)胞分為9組，1組為對(duì)照組，不做藥物處理。其中4組直接暴露于：5%、10%、20%和30% CSE。另外4組加入1 mmol/L NAC后再暴露于上述濃度的CSE中。每組設(shè)5個(gè)平行孔，另外設(shè)調(diào)零孔。加入MTT后用Biotek elx800酶標(biāo)儀，測定各孔在490 nm處的吸光度。

1.5 細(xì)胞周期分析

根據(jù)MTT分析的結(jié)果，選用20% CSE做后續(xù)研究較為適宜。將A549細(xì)胞以2×106個(gè)/孔種植于6孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組，20% CSE處理組，20% CSE+1 mmol/L NAC組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。使用預(yù)冷的冰PBS洗滌細(xì)胞，然后使用70%預(yù)冷乙醇，4 ℃固定12 h。接著，使用PBS再次洗滌細(xì)胞，加入50 mg/L碘化丙啶(PI)500 μL，4 ℃避光染色30 min。隨后，使用流式細(xì)胞儀(BD FASCCalibur system)分析細(xì)胞周期。

1.6 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞的分組處理同上。處理完成后收集細(xì)胞，使用預(yù)冷冰PBS洗滌細(xì)胞，離心后使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒中提供的重懸緩沖液500 μL重懸浮細(xì)胞。依次加入5 μL Annexin V以及10 μL PI，常溫避光靜置10 min后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測定

細(xì)胞的處理和分組方法同上，收集處理后的細(xì)胞，使用無血清DMEM洗滌細(xì)胞，接著加入10 μmol/L DCFH-DA探針，在37 ℃孵育30 min。使用熒光分光光度計(jì)(RT-970)檢測細(xì)胞內(nèi)熒光水平。激發(fā)波長設(shè)為485 nm，發(fā)射波長設(shè)為533 nm。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測IGFBP-3 的mRNA水平變化

細(xì)胞分組處理同上，處理后使用RNA iso裂解試劑提取每孔細(xì)胞的RNA。使用核酸蛋白儀驗(yàn)證提取產(chǎn)物的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×PrimeScript 緩沖液2.0 μL，PrimeScript Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL，Oligo引物0.5 μL，隨機(jī)引物0.5 μL，RNA模板1.0 μL，無酶滅菌水5.5 μL。反應(yīng)條件為：1)37 ℃ 15 min； 2)85 ℃ 5 s。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒對(duì)上述合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

IGFBP-3 的上游引物為：5′-CAGCCAGCGCGCT ACAAGTTGACTA-3′,ACTB下游下游引物為：5′-CT GGGACTCAGCACATTGAGGA-3′,β-actin的上游引物為：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物為：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應(yīng)體系：SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10.0 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。反應(yīng)步驟為：1)95 ℃ 持續(xù)30 s，循環(huán)1次； 2)95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)在MJ research公司的PTC-200 PCR儀中進(jìn)行。使用Rotor gene 6軟件查看分析反應(yīng)結(jié)果，使用2-△△CT法分各樣本的IGFBP-3的相對(duì)表達(dá)情況。

1.9 Western blot檢測IGFBP-3的蛋白水平變化

分組處理同前， RIPA蛋白裂解液(500 μL/孔)提取蛋白，用BCA蛋白定量分析盒定量，確保每孔上樣量為30 μg。使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120 V，時(shí)間為2 h。隨后在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒流250 mA，時(shí)間為1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用小鼠抗人IGFBP-3抗體(1∶500)與小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育12 h。接著使用PBST洗滌3次，除去未結(jié)合的一抗。使用Dy-Light 800紅外標(biāo)記的二抗避光孵育膜2 h，隨后使用PBST洗滌3次，除去多余二抗，利用Odyssey遠(yuǎn)紅外呈像系統(tǒng)分析蛋白條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NAC可以抵抗香煙煙霧提取物造成的細(xì)胞損傷

CSE呈劑量依賴關(guān)系對(duì)A549造成殺傷，減低細(xì)胞的存活率。加入1 mmol/L NAC后，與單純CSE刺激相比，細(xì)胞存活率有所上升(Plt;0.05)(圖1)。

*Plt;0.05 compared with group without NAC treatment 圖1 CSE和NAC對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Cell viability in A549 cells after treatment with CSE and NAC

2.2 細(xì)胞周期

對(duì)照組的G1期百分比為42.35%±2.41%，G2期百分比為17.25%±0.66%(n=3).對(duì)于20%CSE處理組來說，G1期百分比為66.59%±6.95%，G2期百分比為6.19%±4.90%。同時(shí)20% CSE+NAC組的G1期百分比為53.14±9.34%，G2期百分比為12.38%±3.92%。各組間相比(Plt;0.05)(圖2)。

2.3 細(xì)胞凋亡分析

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析發(fā)現(xiàn)，20% CSE處理后，細(xì)胞的總凋亡率為35.83%±2.56%(右上象限+右下象限)顯著高于照組的總調(diào)亡率4.08%±1.89%(Plt;0.05，n=3)。加入NAC后，細(xì)胞總調(diào)亡率降至28.51%±2.26%(Plt;0.05)(圖3)。

2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平分析

20% CSE組的ROS水平有所上升，加入NAC后，ROS水平下降，各組間(Plt;0.05，n=3)(圖4)

圖2 CSE和NAC處理后細(xì)胞周期的變化Fig 2 Cell cycle analysis by flow cytometric after CSE and NAC treatment

圖3 CSE和NAC處理后的細(xì)胞凋亡率Fig 3 Values for cell cycle and cell apoptosis by flow cytometric analysis after CSE and NAC treatment

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖4 CSE和NAC處理后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平Fig 4 Intracellular ROS level change after treated with CSE and NAC

2.5 IGFBP-3表達(dá)水平的變化

CSE刺激細(xì)胞后， IGFBP-3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(Plt;0.05)，加入NAC后，IGFBP-3的表達(dá)水平有所回降但仍高于對(duì)照組(Plt;0.05)(圖5,6)。

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖5 CSE和NAC處理后IGFBP-3 mRNA水平的相對(duì)倍數(shù)變化Fig 5 Relative fold changes of IGFBP-3 mRNA after CSE or SFN treatment

*Plt;0.05 compared with normal control group； #Plt;0.05 compared with 20% CSE group圖6 CSE和NAC處理后IGFBP-3蛋白表達(dá)水平的變化Fig 6 IGFBP-3 protein expression after treated with CSE and NAC

3 討論

香煙煙霧損傷肺泡的機(jī)制之一就是引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而阻礙細(xì)胞增殖，引發(fā)凋亡或者壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，造成G1期阻滯，提高細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，從而導(dǎo)致A549細(xì)胞存活率降低，出現(xiàn)增殖障礙。而使用NAC處理細(xì)胞后， 細(xì)胞凋亡與周期阻滯等不良后果明顯得到緩解。結(jié)果提示，NAC的確可以抵抗CSE對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的損傷，所以NAC也許可以作為治療預(yù)防慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的藥物。但是，香煙煙霧對(duì)肺組織的損傷不僅限于對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的殺傷，除了抗氧化，抑制凋亡，NAC是否其他方面的保護(hù)作用也值得進(jìn)一步研究。比如有結(jié)果表明，香煙煙霧還可以引起肺組織的纖維化[6]，NAC是否可以緩解香煙煙霧造成的纖維化，還不得而知，可在未來實(shí)驗(yàn)中再行研究。研究中使用CSE刺激A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A549出現(xiàn)了生長抑制和凋亡等現(xiàn)象，同時(shí)伴有IGFBP-3表達(dá)的增高。在使用NAC預(yù)處理細(xì)胞后，經(jīng)過同樣濃度的CSE處理，細(xì)胞的凋亡不再那么明顯，同時(shí)也沒有觀察到IGFBP-3的高表達(dá)。這個(gè)結(jié)果暗示，IGFBP-3可能在CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起著促進(jìn)凋亡的作用。

IGFBP-3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及依賴IGF-1途徑以及非依賴IGF-1途徑。前者認(rèn)為，IGFBP-3可以與IGF-1特異性結(jié)合，這樣與IGF-1受體結(jié)合的IGF-1被減少，活性被抑制，細(xì)胞由于缺少IGF-1，因而生長受限，出現(xiàn)凋亡[7]。后者認(rèn)為IGFBP-3發(fā)揮凋亡作用還與其他一些凋亡調(diào)控因子有關(guān)。如有研究表明，IGFBP-3可以抑制NF-κB的活性，后者具有抑制凋亡的作用[8]。IGFBP-3也與MAPK通路有關(guān)[9]，有研究表明，IGFBP-3可以加強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的MAPK通路成員P38的活化，從增加細(xì)胞凋亡[10]。除此之外，IGFBP-3和很多其他的凋亡調(diào)控因子相關(guān)，比如BAX，BAD等[11]。在香煙煙霧的刺激中，IGFBP-3是如何發(fā)揮作用的還有待進(jìn)一步的研究?，F(xiàn)有研究只發(fā)現(xiàn)香煙煙霧造成的細(xì)胞損傷伴隨有IGFBP-3的表達(dá)增高，后續(xù)研究可使用siRNA干擾技術(shù)，降低IGFBP-3的表達(dá)，再使用CSE進(jìn)行刺激，然后觀察細(xì)胞的損傷是否有所減輕從而進(jìn)一步揭示香煙煙霧引發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

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NAC relieves the A549 cells injury induced by cigarette smoke extract

ZHANG Qiang-nu, JIAO Zong-xian*,CHANG Jia-chen

(Institute of Pathology，School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

ObjectiveTo study the protective role of N-acetylsteine in the A549 cell injury caused by cigarette smoke exact and the expression change of insulin-like growth factor binding protein -3 in this process.MethodsMTT assay was used to evaluate cell viability. Cell cycle and apoptotic cell proportion in each group detected respectively by PI and AnnexinV-FITC/PI double-labelled flow cytometry. Intracellular reactive oxygen species (ROS) was estimated by fluorescent indicator H2DCFDA. DAPI was used to observe the nuclear morphology. Furthermore, using real-time quantitative RT-PCR as well as western blot methods,the expression level of IGFBP-3 was detected.ResultsCompared with control group(0.78±0.03), CSE inhibit cell proliferation significantly(0.55±0.04). NAC can reduce cell injury caused by CSE including restoring the viability of A549 cells(0.67±0.04), attenuating G1block of cell cycle and significantly reducing the proportion of apoptotic cells and so on. High expression of insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) in A549 cells treated with CSE was found at both transcriptional and protein levels, and concomitant with the restoration of cell growth after treatment with NAC, down regulation of IGFBP-3 was observed.ConclusionsIt is concluded that NAC can antagonize CSE-induced growth arrest of alveolar epithelial cells and that down regulated IGFBP-3, which probably play an important role in this process.

IGFBP-3; cigarette smoke extract; alveolar epithelial cells; NAC

2013-01-21

2013-05-19

蘭州大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2009-92,lzujbky-2013-223)

*通信作者(correspondingauthor)：jiaozongx@lzu.edu.cn

1001-6325(2014)01-0072-06

R 365

A