心康沖劑對(duì)慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表達(dá)的影響

譚 雄，張 輝，聶孝平，王建國，毛湘屏，陳朝暉，毛以林*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

慢性心力衰竭 （Chronic heart failure，CHF）是各種心血管疾病的終末階段，病死率高，水潴留是其最重要的病理生理變化之一[1]。 研究表明CHF 時(shí)水潴留機(jī)制的主要途徑：心輸出量下降，由下丘腦產(chǎn)生的血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）水平升高，作用于腎臟集合管主細(xì)胞AVPV2 受體，通過異三聚體G 蛋白(Gs 蛋白)激活膜內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，使主細(xì)胞內(nèi)cAMP 升高， 繼而激活胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，使AQP2 發(fā)生磷酸化并由胞漿囊泡向管腔膜轉(zhuǎn)移，通過胞吐作用融合并嵌入管腔膜，水通道開放，形成水潴留[2]。 前期臨床研究表明，臨床效方心康飲對(duì)慢性心衰合并利尿劑抵抗的患者具有良好效果［3］，現(xiàn)將該方制作成顆粒沖劑，觀察其對(duì)慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA的影響，進(jìn)一步探討其抗心衰作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠70 只， 體質(zhì)量180～220 g， 由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司提供動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 藥物 鹽酸多柔比星，深圳萬樂藥業(yè)(批號(hào)：1206E5)； 芪藶強(qiáng)心膠囊， 石家莊以嶺藥業(yè) （批號(hào)：123901）； 心康沖劑（黃芪30 g， 白參10 g， 陳皮10 g，茯苓15 g，桂枝6 g，制附片10 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，砂仁6 g），經(jīng)湖南省中醫(yī)院藥劑科制成顆粒劑（15 g/包），每克相當(dāng)于生藥3.38 g。

1.1.3 試劑 常規(guī)化學(xué)試劑由北京化學(xué)試劑公司提 供；Tris、Trizol、DEPC 均 由Sigma 提 供；SYBGREEN PCR Mix Mix、Taq 酶、 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、DL1000 DNA Marker、dNTP 均 購 于Genstar；EDTA由Fermentas 提供；E.B.購買于ABI；水合氯醛由天津科密歐化學(xué)試劑公司提供。

1.1.4 儀器 旋渦混合器VORTEX-5、 搖床ZD-2008（江蘇海門其林貝爾儀器公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)5417R (德國eppendorf 公司)； 熒光定量RCP 儀Thermo Scientific/ARL（美國Thermo 公司）；水平瓊脂糖電泳儀DYCP-34A（北京六一儀器廠）；電動(dòng)玻璃勻漿器DY89-Ⅱ （寧波新芝科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 利用EXCEL 表格隨機(jī)數(shù)生成法抽取10 只大鼠為正常對(duì)照組， 其余大鼠造模成功后，分為模型對(duì)照組，心康沖劑低、中、高劑量組，芪藶強(qiáng)心組（對(duì)照組），每組各12 只。

1.2.2 造模方法 參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，除正常組外，其余各組使用鹽酸多柔比星腹腔注射法建立心衰動(dòng)物模型2 mg/kg，每周1 次，共10 周，總劑量為20 mg/kg。預(yù)實(shí)驗(yàn)建模結(jié)束后，處死大鼠速取心臟，投入10%甲醛溶液固定24 h， 石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.3 給藥方法 大鼠給藥劑量按等效體表面積折算[8]，心康沖劑等效（低）劑量組、2 倍等效（中）劑量組、4 倍等效（高）劑量組，給藥劑量分別為1.08、2.16、4.32 g/kg；對(duì)照組灌服芪藶強(qiáng)心膠囊，按等效劑量給藥濃度為0.06 g/kg；空白、模型對(duì)照組均灌服等體積蒸餾水。 以上各組均每天灌胃1 次，2 mL/次。

1.2.4 Real-time PCR 法檢測AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表達(dá) 第6 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 各組隨機(jī)取存活大鼠6 只， 取下丘腦及腎臟，Trizol 法提取總RNA，以總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行， 紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度。 引物由上海生工提供。 以β-actin 為內(nèi)參基因，引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，使用Primer primer5軟件設(shè)計(jì)完成，β-actin-F：5’- CATCCTGCGTCTGGACCTGG -3’，β -actin -R：5’ -TAATGTCACGCA GATTTCC-3’ 擴(kuò)增片段長度107 bp，AQP2-F：5’-GGGACCTGGCGTCAATGCTC -3’AQP2 -R：5’ -GCTCGTCGGTGGAGGCAAAGAT-3’擴(kuò)增片段長度114 bp，AVPV2-F：5’-CTGGCACCAGACTGGCGTGTAT-3’，AVPV2 -R：5’ -TGCTCAGCGTGATGTGGGAAAT-3’擴(kuò)增片段長度182 bp，由上海生工合成提供。 PCR 反應(yīng)體系為30 μL，包括上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR H2O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL， 擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃10 min；退火/延伸59 ℃50 s，共40 次循環(huán)。 采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)。 Ct 為目的基因擴(kuò)增到預(yù)定熒光信號(hào)強(qiáng)度所需要的循環(huán)數(shù)，ΔCt為目的基因Ct 與同一樣品action 的Ct 的差值，ΔΔCt 為目的樣品與空白組樣品ΔCt 之間的差，每一組都以空白組樣品為1，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，每一個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察心肌病理改變

與文獻(xiàn)報(bào)道[7]大致符合CHF，證明造模成功。 結(jié)果如圖1、2 所示，見封三彩圖。

2.1 RT-PCR 溶解曲線分析

結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組AQP2 和AVPV2 溶解曲線中均有單一的主峰，溶解溫度為84 ℃，相同擴(kuò)增條件下重復(fù)多次，得到的AQP2 和AVPV2 溶解溫度均在 （84±1）℃， 說明擴(kuò)增的為特異性產(chǎn)物。見圖3-4。

圖3 腎臟集合管主細(xì)胞AQP2 溶解曲線（n=3）

圖4 腎臟集合管主細(xì)胞AVPV2 溶解曲線（n=3）

2.2 AQP2 和AVPV2mRNA 表達(dá)的2-ΔΔCt 值

結(jié)果顯示， 心康沖劑可顯著抑制AQP2mRNA、AVPV2mRNA 在心力衰竭大鼠腎臟集合管主細(xì)胞的過度表達(dá)，從而減少水潴留。 見圖5-6。

圖5 腎臟集合管主細(xì)胞AQP2 擴(kuò)增曲線（n=3）

圖6 腎臟集合管主細(xì)胞AVPV2 擴(kuò)增曲線（n=3）

2.3 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較

與正常對(duì)照組相比， 模型組的AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比芪藶強(qiáng)心組、 心康沖劑各組AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 與 芪 藶 強(qiáng) 心 組 相 比， 心 康 沖 劑 各 組AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達(dá)下調(diào)更為明顯 （均P＜0.05）；心康沖劑各組間AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較●P＜0.05；與模型組比較○P＜0.05；與芪藶強(qiáng)心組比較△P＜0.05。

組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組芪藶強(qiáng)心組心康低劑組心康中劑組心康高劑組藥物濃度(g/mL)— —0.06 1.08 2.16 4.32 AQP2mRNA 1.067±0.064 4.622±0.125●3.585±0.080●○2.313±0.090●○△2.359±0.066●○△2.393±0.079●○△AVPV2mRNA 1.202±0.084 5.444±0.414●3.789±0.362●○2.367±0.273●○△2.482±0.259●○△2.691±0.260●○△

3 討論

慢性心力衰竭（CHF）是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈和射血功能受損的一組復(fù)雜臨床綜合征，有典型的癥狀（即呼吸困難、疲乏）和液體潴留（肺淤血或外周水腫）[11]。利尿劑是唯一能充分控制和有效消除液體潴留的藥物， 但并不能維持長期的穩(wěn)定臨床療效。 慢性心衰屬于中醫(yī)學(xué) “胸痹”、“厥心痛”、“水腫”等范疇。 毛以林主任醫(yī)師通過長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)其病機(jī)關(guān)鍵是宗氣下陷、脾腎陽虛、水濕內(nèi)停，并制定出以升補(bǔ)宗氣、溫陽利水為基本治法的臨床效方心康沖劑。 方中大劑黃芪升補(bǔ)下陷之宗氣，白參補(bǔ)心肺之氣共為君藥，前者補(bǔ)中帶升，后者補(bǔ)氣雄厚；柴胡、升麻提升清陽之氣；桔梗為舟揖之藥，載諸藥上達(dá)而使藥至病所；茯苓、薏苡仁甘淡健脾利水；生姜皮、大腹皮專利肌膚之水；砂仁化濕運(yùn)脾，陳皮理氣，因氣能行水化水；制附片溫補(bǔ)腎陽，桂枝溫陽化氣，諸藥和而為功。

在慢性心衰水潴留機(jī)制中，腎臟是水潴留的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 AQP2 主要位于腎臟集合管主細(xì)胞管腔側(cè)的囊泡內(nèi)，是腎臟重吸收水分，濃縮尿液，調(diào)節(jié)機(jī)體水鈉平衡的關(guān)鍵蛋白，在慢性心衰水潴留中發(fā)揮重要作用[12]，主要體現(xiàn)在AQP2 通過調(diào)節(jié)插入集合管上皮細(xì)胞頂端膜上的數(shù)量來調(diào)節(jié)集合管對(duì)水的通透性，調(diào)控主要有短期調(diào)控與長期調(diào)控兩種方式[13]：一是AVP 與腎集合管主細(xì)胞V2 受體結(jié)合激活蛋白激酶A，使胞漿囊泡中的AQP2 發(fā)生磷酸化，觸發(fā)AQP2 向管腔膜轉(zhuǎn)移，融合嵌入管腔膜，致管腔膜上的AQP2 密度增加，水通道開放，水的通透性增加，此即短期調(diào)控的“穿梭機(jī)制”；二是AVP 水平持續(xù)升高可長期刺激主細(xì)胞促使AQP2 基因活化， 在轉(zhuǎn)錄水平使AQP2 增加，集合管AQP2 絕對(duì)數(shù)量增加，從而增加水的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[14-15]。 從而導(dǎo)致水鈉潴留，心臟容量負(fù)荷增加，加重心功能衰竭。

本研究發(fā)現(xiàn)心康沖劑能夠下調(diào)心衰大鼠腎臟AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表達(dá)， 這可能系該方臨床具有良好利尿效果，從而減少水潴留，改善心功能作用機(jī)制之一，值得進(jìn)一步探索研究。

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