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    RNA干擾技術(shù)沉默MMP-9基因?qū)HP-1細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究①

    2014-11-27 10:26:44凌云志韓昂軒徐鵬琛高乾乾
    中國免疫學(xué)雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:活率基因治療胞外基質(zhì)

    禹 莉 凌云志 肖 霄 韓昂軒 彭 柯 徐鵬琛 高乾乾

    (蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系輸血學(xué)教研室 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,蚌埠 233030)

    白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病,嚴(yán)重威脅人類健康。浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性,也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因?;|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用,逐漸成為惡性腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。在基因治療方面,反義寡核苷酸和干擾技術(shù)用來干擾MMP基因表達(dá),作為新的分子靶點(diǎn),為腫瘤的基因治療提供新的、有前途的手段。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)所引起的序列特異性基因沉默。RNA干擾效應(yīng)具有兩個(gè)明顯的特征:特異性和高效性。與其他方法相比,RNAi技術(shù)在基因功能研究上有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[1-3]:簡單易行,容易開展;與基因敲除相比實(shí)驗(yàn)周期短,成本低;與反義技術(shù)相比,具有高度特異性和高效性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成針對MMP-9基因的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),并轉(zhuǎn)染人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1細(xì)胞,分析siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的變化及其對THP-1細(xì)胞增殖的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料細(xì)胞株 THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)液、新生牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000為 Invitrogen公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒(MBI Fermentas公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);羊抗MMP-9抗體(Santa Cruz公司);細(xì)胞裂解液、PMSF、TEMED、電泳液、封閉液、轉(zhuǎn)膜液(碧云天公司),化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液(Millipore公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 目的siRNA的設(shè)計(jì)合成 參考文獻(xiàn)[4],根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,從基因編碼區(qū)選擇靶序列1 324~1 344核苷處,委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成 siRNA,如下:5'-UUC AGG GCG AGG ACC AUA GAG-3'。并選取無意義序列作為陰性對照(siRNAN):5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT-3'。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞接種于含10% 滅活新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,置37℃飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d細(xì)胞換液傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

    1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分為3組:空白對照組(不轉(zhuǎn)染siRNA,只應(yīng)用Lipofectamine 2000)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無意義序列)和siRNA組(轉(zhuǎn)染 MMP-9 siRNA)。轉(zhuǎn)染時(shí)以50 nmol/L的濃度用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按說明書操作分別轉(zhuǎn)染接種細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑說明書提取不同處理組細(xì)胞總RNA。取3 μl總RNA為模板,用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此cDNA 2 μl為模板,PCR擴(kuò)增,所用引物見表1,引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系終體積為50 μl,反應(yīng)條件:94℃5 min,94℃ 變性1 min,60℃ 退火30 s,72℃ 延伸1 min,35個(gè)循環(huán)后72℃ 平衡10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Smart view圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

    1.2.5 Western blot法檢測MMP-9蛋白表達(dá) 收集3組THP-1細(xì)胞,用預(yù)冷的裂解液裂解,按說明書操作提取蛋白,Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE(8%分離膠,5% 濃縮膠)電泳后,蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上;封閉液封閉,分別加入稀釋的一抗37℃孵育2 h;TBST洗膜后,加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h,TBST洗膜?;瘜W(xué)發(fā)光增強(qiáng)液與膜充分接觸,曝光,凝膠成像系統(tǒng)成像。

    1.2.6 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測THP-1細(xì)胞的增殖能力 將3組細(xì)胞接種于96孔板(調(diào)整細(xì)胞濃度為 5 ×104ml-1),每孔200 μl,培養(yǎng)48 h;加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清后每孔加入200 μl DMSO,避光振蕩10 min,使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解,酶標(biāo)儀上讀取A570 nm值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次做5個(gè)平行孔,按照公式計(jì)算生長抑制率,抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值)×100%。

    1.2.7 細(xì)胞活率和形態(tài)觀察 調(diào)整3組細(xì)胞濃度為2 ×105ml-1,每瓶含5 ml培養(yǎng)液,培養(yǎng) 48、72 h,計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù),用0.4%臺盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每次每瓶計(jì)數(shù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取各組細(xì)胞先在倒置顯微鏡下觀察,再將細(xì)胞懸液離心涂片,用Wright染色,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá) 3組細(xì)胞均可見MMP-9基因電泳帶存在,但其亮度存在差異,siRNA轉(zhuǎn)染組mRNA經(jīng)RT-PCR后電泳帶亮度明顯弱于陰性對照組和空白對照組(圖1)。電泳圖譜經(jīng)圖像軟件分析,siRNA組、陰性對照組和空白對照組MMP-9 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果見表 2,顯示轉(zhuǎn)染 MMP-9 siRNA后,siRNA組MMP-9 mRNA的表達(dá)與陰性對照組和空白對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)。

    表1 擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and length of productions of objective genes and β-actin

    2.2 siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá) Western blot對蛋白質(zhì)測定結(jié)果見圖2,siRNA轉(zhuǎn)染組條帶亮度明顯弱于陰性對照組和空白對照組。經(jīng)圖像軟件分析,結(jié)果顯示:siRNA組、陰性對照組和空白對照組的內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)量無明顯差異,而siRNA組MMP-9蛋白的表達(dá)與空白對照組和陰性對照組比較均有顯著性差異(P<0.05),見表1。

    2.3 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞增殖能力的影響

    siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h,THP-1細(xì)胞的增殖能力與對照組相比較,A570 nm值明顯下降(P<0.05),細(xì)胞生長受到明顯抑制,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長,生長抑制率增加。表明MMP-9 siRNA具有抑制THP-1細(xì)胞增殖的能力(表3)。

    2.4 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞活率的影響siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h,THP-1細(xì)胞活率為與空白對照組及陰性對照組相比較明顯下降(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見表4,表明MMP-9 siRNA能夠抑制THP-1細(xì)胞生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

    圖1 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達(dá)Fig.1 Express of MMP-9 mRNA by RT-PCR

    圖2 Western blot檢測MMP-9蛋白的表達(dá)Fig.2 Express of MMP-9 protein by Western blot

    2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下可見空白對照組和陰性對照組細(xì)胞呈半貼壁生長,細(xì)胞輪廓清楚,形態(tài)均一,生長旺盛。而siRNA組細(xì)胞生長受抑,細(xì)胞集落減少,大小不一,胞膜明顯皺縮,細(xì)胞中顆粒增多,細(xì)胞碎片增多,見圖3。經(jīng)Wright染色后觀察,對照組THP-1細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞膜完整,染色質(zhì)疏松,呈紫紅色,核仁清晰,胞漿量少;siRNA組細(xì)胞形態(tài)有明顯改變,大小不一,細(xì)胞著色不均,大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積縮小,細(xì)胞核固縮,核內(nèi)染色質(zhì)濃縮凝聚,出現(xiàn)核邊聚、核碎裂、核溶解,并可見典型的凋亡小體等,見圖 4、5。

    表2 各組MMP-9 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平(,n=3)Tab.2 Express value of MMP-9 mRNA and protein(,n=3)

    表2 各組MMP-9 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平(,n=3)Tab.2 Express value of MMP-9 mRNA and protein(,n=3)

    Note:1)P<0.05 vs blank control group;2)P<0.05 vs negative control group.

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    表3 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞增殖能力的影響(,n=3)Tab.3 Effect of MMP-9 siRNA on proliferation of THP-1 cells(,n=3)

    表3 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞增殖能力的影響(,n=3)Tab.3 Effect of MMP-9 siRNA on proliferation of THP-1 cells(,n=3)

    Note:1)P<0.01 vs blank control group;2)P<0.05 vs negative control group.

    Group 48 h A570 nm value rate of inhibition(%)72 h A570 nm value rate of inhibition(%)Blank control group 0.446 1±0.073 0 0.461 6±0.31 0546 0 Negative control group0.410 8±0.084 4 7.9 0.437 7±0.084 1 5.2 siRNA group 0.350 5±0.061 21)2)21.4 0.318 7±0.062 31)2)

    表4 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞活率的影響(,n=3)Tab.4 Effect of MMP-9 siRNA on motility rate of THP-1 cells(,n=3)

    表4 MMP-9 siRNA對THP-1細(xì)胞活率的影響(,n=3)Tab.4 Effect of MMP-9 siRNA on motility rate of THP-1 cells(,n=3)

    Note:1)P<0.01 vs blank control group;2)P<0.05 vs negative control group;3)P<0.01 vs negative control group.

    Group The motility rate of THP-1 cells(%)48 h 72 h Blank control group 86.89±5.95 85.33±5.66 Negative control group 82.33±3.87 80.11±4.57 siRNA group 73.44±6.481)3) 74.11±6.011)2)

    圖3 倒置顯微鏡下THP-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×400)Fig.3 Changes in morphology of THP-1 cells through inverted microscope( ×400)

    圖4 Wright染色后THP-1細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.4 Morphology of THP-1 cells after Wright stain( ×100)

    圖5 Wright染色后THP-1細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig.5 Morphology of THP-1 cells after Wright stain( ×400)

    3 討論

    白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,在我國,兒童及35歲以下成人惡性腫瘤的死亡率中,其中由白血病引起的居首位,嚴(yán)重威脅人類健康。惡性腫瘤的主要特點(diǎn)是侵襲并向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移,在惡性腫瘤突破細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血管,以及新生血管的出芽過程中都需要降解細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤細(xì)胞對基底膜膠原的溶解是其向細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散的起始,因此基底膜完整性的破壞被認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲開始的一個(gè)標(biāo)志。MMP-9是鋅離子依賴性蛋白水解酶超家族成員之一,具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力,它屬于Ⅳ型膠原酶,主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白-Ⅳ型膠原,并能促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性,促進(jìn)細(xì)胞的遷移[5-7],因此,它在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中占有重要的地位。

    目前急性白血病的主要治療手段是通過細(xì)胞毒藥物殺滅病人體內(nèi)惡性增殖的白血病細(xì)胞,這雖然能使大部分患者獲得緩解和延長生存期,但治愈率低,而且由于化療藥物的非特異性細(xì)胞毒性,往往造成患者治療的相關(guān)性死亡。近年來,隨著分子生物學(xué)與基因工程的研究進(jìn)展,白血病的基因治療已被廣泛研究,部分白血病基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,基因治療不但為白血病開辟出新的治療途徑,而且有可能成為治愈白血病的重要手段。RNAi已成為分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)手段之一,其作用機(jī)制是通過活化的siRNA靶向降解目的mRNA,從而使目的基因表達(dá)沉默。目前,MMP作為抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)的研究已開展。

    在本實(shí)驗(yàn)中,將靶向MMP-9的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞,通過RT-PCR及Western blot方法檢測MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示,在siRNA轉(zhuǎn)染組THP-1細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯受到抑制,顯著低于陰性對照組和空白對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    MTT結(jié)果顯示,siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h,THP-1細(xì)胞的增殖能力與對照組相比較,A570 nm值明顯下降(P<0.05),細(xì)胞生長明顯受到抑制,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長,生長抑制率增加。表明MMP-9 siRNA具有抑制THP-1細(xì)胞增殖的能力。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,siRNA組轉(zhuǎn)染后48、72 h,THP-1細(xì)胞活率與空白對照組及陰性對照組相比較明顯下降,表明MMP-9 siRNA能夠抑制THP-1細(xì)胞生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

    本實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),空白對照組和陰性對照組細(xì)胞呈半貼壁生長,細(xì)胞輪廓清楚,形態(tài)均一,生長旺盛。而siRNA組細(xì)胞生長受抑,細(xì)胞集落減少,大小不一,胞膜明顯皺縮,細(xì)胞中顆粒增多,細(xì)胞碎片增多,經(jīng)Wright染色后觀察,對照組THP-1細(xì)胞呈圓形,染色質(zhì)呈紫紅色,胞漿量少;siRNA組細(xì)胞形態(tài)有明顯改變,大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積縮小,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)核固縮、核邊聚、核碎裂,并可見典型的凋亡小體等。研究表明MMP-9 siRNA能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡??傊?,研究結(jié)果提示:采用siRNA技術(shù)可靶向干擾體外THP-1白血病細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達(dá),在MMP-9表達(dá)受抑后可有效抑制THP-1細(xì)胞的增殖,促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡。這就為包括白血病在內(nèi)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基因治療提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)。

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