MPB64在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達純化及免疫原性鑒定①

徐 丹 姜 潮 陳 昱 艾 君 王曉艷 李校堃

(吉林農業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長春 130118)

結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)引起的通過空氣傳播的人獸共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，在2011年，約有870萬名新增結核病例(13%感染了艾滋病病毒)和140萬人死于結核病［1］。結核病已成為我國乃至世界危害最嚴重的疾病之一。1921年，Calmette和Guérin研制出減毒分枝桿菌Bacille Calmette-Guérin(BCG)，BCG是目前應用最廣泛的結核分枝桿菌疫苗，但BCG保護力不穩(wěn)定為0～80%，BCG不能提供有效的免疫保護力來抵抗結核分枝桿菌的感染，尤其對處于潛伏期的結核病患者不會產生任何效果［2，3］，所以急需一種有效的疫苗來控制結核病的蔓延，目前研究最多的是重組BCG、DNA疫苗和亞單位疫苗。

MPB64蛋白是MTB基因組RD2區(qū)基因編碼的蛋白，分子量約為23 kD，只存在于MTB毒株中，不存在于BCG中［4］。MPB64是MTB培養(yǎng)物濾過蛋白的主要成分之一，占分泌蛋白總量的8%，亦是最早被發(fā)現(xiàn)的MTB復合群特異性抗原，可誘導肺結核患者的淋巴細胞增殖并可產生高水平的IFN-γ，能引起較強的細胞和體液免疫，具有開發(fā)成結核病亞單位疫苗和檢測試劑盒的潛力。本研究在桿狀病毒表達載體系統(tǒng)中表達MPB64，希望獲得具有免疫原性的重組蛋白，為MPB64的表達提供新途徑，為結核病的檢測和亞單位疫苗的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒細菌 含有MPB64-His基因序列(昆蟲密碼子優(yōu)化)的pUC57載體、E.coli DH5α菌種均由本實驗室保存;pFastBac載體、E.coli DH10Bac感受態(tài)購自Invitrogen公司。

1.1.2 試劑盒 脂質體轉染試劑盒、Bac-to-Bac表達系統(tǒng)試劑盒、Sf 9昆蟲細胞、Sf-900II無血清培養(yǎng)基購自 Invitrogen;PCR酶、限制性內切酶、DNA Marker 10 000、DNA連接酶購自大連寶生物;質粒提取試劑盒購自北京索萊寶公司;His標簽抗體購自abcom公司;BALB/c小鼠由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供(18只，雌性，6～8周齡);IFN-γ檢測試劑盒購自上海巧伊生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 設計引物 從pUC57-CFP10-ESAT-6-MPB64-His載體中擴增MPB64-His目的基因片段，運用Primer 5.0軟件設計含有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點及保護堿基的上游引物和下游引物，通過PCR克隆得到N端含有6個His標簽的MPB64基因，上游引物 5'CGGGATCCATGAGGATAA3'，下游引物5'CTGCAGCTAGTGATGGTGATG3'。

1.2.2 PCR反應體系 上下游引物各1 μl，模板質粒 1 μl，ExTaq 酶 0.25 μl，dNTP 4 μl，10 × buffer 5 μl，超純水 37.75 μl，50 μl反應體系。94℃ 預變性 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，30 個循環(huán)后72℃延伸8 min。

1.2.3 重組pFastBac-MPB64-His載體的構建PCR獲得的MPB64-His片段和pFastBac質粒分別用BamHⅠ和PstⅠ酶雙酶切并回收需要的片段，目的片段與空載體pFastBac連接后轉化DH5α感受態(tài)，挑選單菌落進行PCR和酶切驗證并由華大基因測序，測序正確的單克隆提質粒進行下一步實驗。

1.2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的構建pFastBac-MPB64-His質粒轉化含有Bacmid載體的DH10Bac感受態(tài)(方法根據(jù)說明書)，轉化后的DH10Bac 菌涂布在五抗(K 50 μg/ml，T 10 μg/ml，G 7 μg/ml，IPTG 40 μg/ml，X-gal 100 μg/ml)固體培養(yǎng)基的平皿上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，藍白斑鑒定陽性菌落，挑取單菌落在五抗平皿中劃線培養(yǎng)，至整個平皿中只有白色菌落，挑取單菌落利用Bacmid中的M13片段和目的基因片段兩端引物進行PCR鑒定。

1.2.5 重組桿狀病毒的制備 取兩份100 μl的SF-900Ⅱ培養(yǎng)基，一份加入 8 μl重組 Bacmid-MPB64-His質粒，另一份加入6 μl Cellfectin Reagen試劑，將兩份溶液混合均勻并室溫孵育45 min，6孔板加入對數(shù)生長期的Sf 9細胞，每孔1.0×106個，27℃靜止培養(yǎng)1 h，輕輕移去培養(yǎng)基，加入上述混合物，27℃靜止培養(yǎng)4 h，移去上述混合溶液，加入2 ml培養(yǎng)基，濕盒中27℃培養(yǎng)72 h后可以看到細胞發(fā)生病變，當發(fā)生病變的細胞大于50%時，收細胞和培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，取上清即是P1代病毒，P1代病毒加入2%胎牛血清4℃避光儲存。P1代病毒連續(xù)轉染細胞3次獲得P4代病毒。

1.2.6 測定P4代病毒滴度 對數(shù)生長期的細胞加入6孔板，每孔2 ml 5×105個/ml，貼壁培養(yǎng)過夜，P4代病毒用培養(yǎng)基稀釋成103～108，移去上清液，每孔加病毒稀釋液1 ml，27℃培養(yǎng)1 h后，移去病毒液，將提前在40℃保溫的4%低熔點瓊脂和1.3×的培養(yǎng)基按1∶3比例混合，并迅速加入6孔板，自然凝固后置于27℃濕盒中靜止培養(yǎng)10～15 d，至每孔中的蝕菌斑數(shù)連續(xù)2 d不變，選擇蝕斑數(shù)在3～20個的孔，病毒滴度的計算公式:滴度(pfu/ml)=每孔蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/1 ml。

1.2.7 轉染條件的優(yōu)化 用P4代病毒轉染對數(shù)生長期細胞，細胞密度2×106個/ml，27℃搖床100 r/min 培養(yǎng)，不同時間取樣(24、48、60、72、84、96、108、120 h)，并取同樣細胞設不同感染復數(shù)(2，3，4，5，6)組，96 h后取樣，SDS-PAGE電泳后，取膠300 mA轉膜75 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，2.5%脫脂奶粉2 000倍稀釋anti-his單克隆抗體，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，3 000倍稀釋二抗，室溫孵育1 h，TBST稀釋3次，曝光。

1.2.8 蛋白純化 A液為20 mmol/L PB，pH8.0;B液為20 mmol/L PB+500 mmol/L NaCl，pH8.0;C 液為20 mmol/L PB+400 mmol/L咪唑，pH8.0。收集細胞培養(yǎng)液，調pH至8.0上Q柱100%A液平衡，16%B液沖洗雜蛋白，30%B液洗脫目的蛋白，100%B液再生Q柱。Q柱收集液上Ni柱，A液平衡，7.5%C液沖洗雜蛋白，50%C液洗脫目的蛋白，100%C液再生Ni柱。純化后蛋白超濾離心除鹽，經SDS-PAGE電泳后，利用灰度分析測定純度，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，計算蛋白表達量。

1.2.9 免疫小鼠 BALB/c小鼠隨機分為三組，每組6只。空白對照組腹腔注射生理鹽水，陽性對照組注射卡介苗BCG，實驗組采用腹腔注射MPB64蛋白免疫BALB/c小鼠3次，每只每次0.05 mg(生理鹽水組0.2 ml/只)，每次間隔2周，每次免疫后第3天斷尾取血，血清儲存在－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 血清中抗體滴度的檢測 BCG和純化的蛋白MPB64分別在碳酸鹽包被緩沖液中稀釋到1.0 μg/ml，100 μl/孔包被酶標板 4℃過夜，PBST 洗3次，分別加入PBS稀釋的血清100 μl/孔，20倍稀釋起始，依次倍比稀釋12個濃度梯度，空白孔用PBS代替，37℃孵育2 h，PBST 洗3次，每孔100 μl加5 000倍稀釋的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗3次，加底物顯色，酶標儀檢測490 nm波長下的吸光值。

1.2.11 脾臟細胞分泌IFN-γ的檢測 BALB/c小鼠免疫后第9周處死，無菌條件下分離脾臟細胞，每孔40萬個細胞鋪96孔板。每孔加入10 μg培養(yǎng)基稀釋的MPB64蛋白，空白對照加入等量培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h后取上清，ELISA方法檢測血清中IFN-γ濃度，實驗步驟按照說明書。

1.2.12 重組蛋白MPB64對脾臟細胞的增殖活性

BALB/c小鼠免疫后第9周處死，無菌條件下分離脾臟細胞，每孔40萬個細胞鋪96孔板。稀釋成不同濃度的重組蛋白給藥，最高濃度100 μg/孔，連續(xù)2倍稀釋10個梯度。以 PBS作為空白對照。37℃培養(yǎng)72 h后每孔加25 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心的除去上清，每孔加120 μl DMSO，震蕩10 min至結晶溶解。在630 nm和570 nm雙波長下測定吸光度，計算重組蛋白對脾臟細胞的增殖活性。

2 結果

2.1 Bacmid-MPB64-His表達載體構建示意圖 桿狀病毒表達載體Bacmid-MPB64-His的構建，如圖1所示?？寺〉腗PB64-His基因插入到桿狀病毒轉移載體pFastBac的BamHⅠ和 PstⅠ酶切位點之間。重組轉移載體pFastBac-MPB64-His轉染DH10Bac感受態(tài)細胞，并在幫助質粒的作用下與DH10Bac中的表達載體Bacmid在mini-Tn7位點發(fā)生轉座，獲得重組MPB64-His質粒。

2.2 目的基因的PCR擴增 MPB64-His基因包括MPB64的687 bp和其后的His標簽以及加兩端的酶切位點共744 bp，結果與預期一致，如圖2所示。

2.3 重組pFastBac-MPB64-His質粒的雙酶切驗證提取pFastBac-MPB64-His質粒，用 BamHⅠ和 PstⅠ雙酶切，酶切大小片段與預期結果一致，如圖3所示。

2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的PCR驗證提取Bacmid-MPB64-His質粒，以MPB64-His的上游引物和M13的下游引物做PCR驗證，電泳結果與預期值1 223 bp一致，如圖4所示。

圖1 桿狀病毒表達載體的構建Fig.1 Construction of recombinant baculovirus expression vector

圖2 PCR擴增MPB64-His基因Fig.2 PCR product of MPB64-His gene

2.5 昆蟲細胞感染病毒后的形態(tài)學鑒定 重組Bacmid-MPB64-His載體在轉染試劑的介導下轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞，昆蟲細胞感染病毒72 h后，在顯微鏡下觀察形態(tài)變化，細胞停止生長分裂，細胞內有粒狀物出現(xiàn)，細胞表面出芽，出泡，部分細胞裂解，如圖5所示。

圖3 pFastBac-MPB64-His雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pFastBac-MPB64-His

圖4 PCR鑒定重組桿狀病毒DNAFig.4 Identification of recombinant baculovirus DNA by PCR

2.6 蛋白的表達 P3代病毒轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞，72 h后收集上清經15%SDS-PAGE電泳顯示在23 kD有蛋白表達，如圖6所示。P4代病毒轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞，收集上清做Western blot鑒定，證明細胞感染病毒48 h后有蛋白表達，96 h時蛋白表達量最高，感染復數(shù)(MOI)為4時蛋白收獲最高，如圖7所示。

2.7 蛋白的純化 收集上清上樣于Q柱，洗脫樣品在SDS-PAGE電泳顯示目的條帶在含0.15 mol/L NaCl的PB緩沖液中洗脫，洗脫樣品上樣于Ni親和層析柱，用含咪唑的PB緩沖液洗脫，樣品經12%SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白在含0.2 mol/L咪唑的PB緩沖液中洗脫。灰度分析測定蛋白純度為91%。洗脫樣品除鹽后測定蛋白濃度，計算上清中蛋白收量為35 mg/L，如圖8所示。

2.8 血清中抗體效價測定 MPB64免疫組血清中抗體效價的測定在20～5 120倍間呈S形曲線，最佳稀釋倍數(shù)為2 000倍。MPB64免疫組明顯高于BCG對照組，結果如圖9所示。

圖5 正常及感染后的Sf 9細胞形態(tài)Fig.5 Normal Sf 9 and Sf 9 cells infected after 72 h

圖6 病毒感染細胞后的蛋白表達Fig.6 Protein expression after virus infected cells

圖7 Western blot檢測不同時間和感染復數(shù)表達蛋白表達情況Fig.7 Detection of expression of recombinant MPB64-His protein in different infection time and various MOI infection by Western blot

圖8 MPB64蛋白純化結果Fig.8 Purification of MPB64

圖9 血清抗體的滴度Fig.9 Serum antibody titer

2.9 脾臟細胞分泌IFN-γ的檢測 免疫后的第9周，取小鼠脾臟細胞培養(yǎng)在96孔板，加入10μg蛋白MPB64刺激，72 h后培養(yǎng)基中IFN-γ的含量為35.75 pg/ml，明顯高于空白對照組的1.28 pg/ml，如圖10所示。

圖10 培養(yǎng)基上清中IFN-γ的含量Fig.10 Supernatant levels of IFN-γ

圖11 MPB64促脾臟細胞增殖研究Fig.11 MPB64 promoted splenic lymphocytes cells proliferation

2.10 重組蛋白對脾臟細胞的增殖活性驗證 酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值，數(shù)據(jù)如圖11所示，由數(shù)據(jù)顯示重組蛋白對免疫過的小鼠脾臟細胞有明顯的促增殖作用，在蛋白濃度0.2～100 μg/ml之間呈劑量依賴性。

3 討論

自1990年以來，TB已經受到世界各國的重視，每年新增病例以及死亡人數(shù)持續(xù)減少，但由于耐藥TB的出現(xiàn)以及結核病例感染艾滋病毒，使得TB控制的進展極為緩慢。我國在全球22個TB重災區(qū)中僅次于印度排名第二［5，6］。TB的治療費用高，且因耐藥甚至耐多藥株的出現(xiàn)使TB的多種藥物作用降低，尤其是耐多藥TB的治療副作用較大，治療周期延長。

BCG仍是目前預防TB唯一可用的疫苗。BCG的制備和傳代過程中丟失了部分與保護力相關的基因。接種BCG可顯著降低兒童TB的發(fā)病率和死亡率，但對成人的免疫效果極不穩(wěn)定，保護力為0～80%，而且BCG仍存在一定毒力，最近研究顯示BCG與臨床致病結核分枝桿菌有很大不同，BCG對流行的臨床菌株北京株缺乏有效作用［7］。

亞單位疫苗與BCG相比，具有組分明確、生產周期短、價格低廉、無毒安全等優(yōu)點，已受到國內外眾多學者的青睞，目前已知的保護性抗原有MTB早期分泌蛋白ESAT6、CFP10、MPB64和Ag85B復合物等［8］。

桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS)是1983年由Smith等［9］建立，具有蛋白表達水平高、周期短、對目的蛋白有翻譯后修飾作用等優(yōu)點［10，11］。它幾乎可以表達任何生物(從細菌到人體組織)的基因產物和進行任何細胞定位(細胞內、細胞外周質)，已廣泛用于生物制藥、基因工程及疫苗的研究及生產，其中在該系統(tǒng)中生產的流感疫苗和豬瘟亞單位疫苗具有良好的效果［12，13］。

本實驗在桿狀病毒表達載體系統(tǒng)成功地表達了結核分枝桿菌蛋白MPB64并進行純化，又進一步驗證重組蛋白MPB64的免疫原性，證明重組蛋白可以刺激BALB/c小鼠產生抗體，提高BALB/c小鼠血清中IFN-γ的含量。IFN-γ可激活巨噬細胞，增強巨噬細胞殺傷能力，抑制MTB生長，最終產生抗TB的保護效應。

目前，我國結核感染皮試診斷及流行病學調查主要采用PPD(結核桿菌精致純蛋白衍生物)皮試。但PPD中存在致病性分枝桿菌、環(huán)境中的分枝桿菌及BCG所共有的抗原，因而不能區(qū)分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結核桿菌感染，特異性和敏感性均不理想。因MPB64只存在于致病性結核分枝桿菌，不存在于作為疫苗的BCG中，純化后的重組蛋白除可作為疫苗外，可用于制備檢測試劑盒，檢測接種人群的抗體表達量。對比PPD檢測可以區(qū)別BCG免疫和MTB感染。本課題組在以上實驗的基礎之上，將繼續(xù)對MPB64免疫原性進一步檢測，并對重組蛋白MPB64進行保護力的探究和嘗試，利用重組蛋白MPB64對TB檢測進行開發(fā)。

［1］趙 鋼，杜 芳.結核性腦膜炎臨床診斷思路［J］.中國現(xiàn)代神經疾病雜志，2013，13(1):1-4.

［2］Skeiky YA，Sadoff JC.Advances in tuberculosis vaccine strategies［J］.Nat Rev Microbiol，2006，4(6):469-476.

［3］Fine PE.Variation in protection by BCG:implications of and for heterologous immunity ［J］.Lancet，1995，346(8986):1339-1345.

［4］Kamath AT，F(xiàn)eng CG，Macdonald M，et al.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacteria tuberculosis［J］.Infect Immun，1999，67(4):1702-1707.

［5］Centers for Disease Control and Prevention.Development of new vaccines for tuberculosis，recommendations of the advisory council for the elimination of tuberculosis(ACET)［J］.Morb Mortal Wkly Rep，1998，47:1-6.

［6］Floyd K，Blanc L，Raviglione M，et al.Resources required for global tuberculosis control［J］.Science，2002，295(3):2040-2041.

［7］Tsenova L，Harbacheuski R，Sung N，et al.BCG vaccination confers poor protection against M.tuberculosis HN878-induced central nervous system disease［J］.Vaccine，2007，25(28):5126-5132.

［8］Doherty TM，Andersen P.Tuberculosis vaccine development［J］.Curr Opin Pulm Med，2002，8(3):183-187.

［9］Smith GE，F(xiàn)raser MJ，Summers MD.Molecular engineering of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus genome:deletion mutations within the polyhedrin gene［J］.J Virol，1983，46(2):584-593.

［10］Schmidt FR.Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，65:363-372.

［11］Van ND，F(xiàn)ortunati E，Ehlert E，et al.Baculovirus infection of nondividing mammalian cells:mechanisms of entry and nuclear transport of capsids［J］.J Virol，2001，75:951-970.

［12］Blanchard P，Mahe D，Cariolet R，et al.Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)by porcine circovirus type 2(PCV2)proteins［J］.Vaccine，2003，21:4565-4575.

［13］Cox MJ，Hollister JR.FluBlok，a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells［J］.Biologicals，2009，37:182-189.