γδT細(xì)胞在急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的變化分析①

常 琳 王 磊 彭 輝 陳 敏 (重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所，感染性疾病分子生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400010)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)為一種噬肝病毒，感染后可致乙型肝炎、肝硬化等多種嚴(yán)重肝病，嚴(yán)重威脅生命健康。研究表明，在急性HBV感染過程中，HBV感染肝細(xì)胞后，可激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，包括激活多種非特異性免疫細(xì)胞及特異性免疫細(xì)胞等，使機(jī)體最終清除HBV，同時(shí)產(chǎn)生HBV特異性的抗體及記憶型免疫細(xì)胞[1-3]。肝臟中自然殺傷細(xì)胞(Nature killer cells，NK)、自然殺傷T細(xì)胞(Nature killer T cells，NKT)及 γδT 細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞含量豐富，可占全部肝臟淋巴細(xì)胞的三分之二，在抗HBV感染免疫中起到了很重要的作用[4-6]。γδT細(xì)胞是除 NK、NKT外的另一種重要的非特異性免疫細(xì)胞，可在多種細(xì)菌或病毒感染中發(fā)生激活，起到免疫清除或免疫調(diào)節(jié)的作用[7-9]。但目前γδT細(xì)胞在急性HBV感染中的作用還未見相關(guān)報(bào)道。因此本文擬通過尾靜脈高壓水動(dòng)力法注射HBV質(zhì)粒構(gòu)建急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型，直接分析肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的變化，并與外周血及脾臟中的γδT細(xì)胞比較，從而初步探討γδT細(xì)胞在HBV急性感染清除機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 含HBV全基因組(ayw亞型)1.3倍體真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-HBV1.3)及空載體pcDNA3.1均為本所(重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所)保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)雌性C57BL/6J小鼠45只，4～6周齡，體重(16～20)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將鼠隨機(jī)分為9組，每組各5只，包括正常對(duì)照組(NC)、pcDNA3.1-HBV1.3質(zhì)粒1天(pHBV1d)、5 天(pHBV5d)、10 天(pHBV10d)、15天(pHBV15d)、pcDNA3.1質(zhì)粒1天(pcDNA1d)、3天(pcDNA3d)、5 天(pcDNA5d)、7 天(pcDNA7d)。小鼠在該中心清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，動(dòng)物房保持通風(fēng)、干燥、室溫(22～25)℃，濕度(50～70)%，自由飲水，鼠料定量飼養(yǎng)。

1.1.3 試劑 Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(14-0161-81，eBioscience)，PerCP Hamster Anti-Mouse CD3e(553067，BD Parmingen)，PE Hamster Anti-Mouse γδ T-cell receptor(553178，BD Parmingen)，PE-Cy5TMAnti-Mouse CD69(15-0691-81，eBioscience)，APC Rat anti-mouse CD25(558643，BD Parmingen)，F(xiàn)ITC Hamster anti-mouse γδ T-cell receptor(553177，BD Parmingen)，PE anti-mouse IFN-gamma(12-7311-81，eBioscience)，PE-Cy7TMRat anti-mouse TNF(557644，BD Parmingen)，膠原酶Ⅳ(C5138，sigma)，DNA 酶Ⅰ(D5025，sigma)，percoll(17-0891-01，Pharmacia)。免疫組化檢測(cè)試劑:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，包括mouse anti-HBsAg(ZM-0421)，mouse anti-HBcAg(ZM-0122)，polymer detection system(PV-6000)等。

1.1.4 設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，centrifuge 5810R)，流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD，BD FACSCantoTMⅡ)。

1.2 方法

1.2.1 急性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型復(fù)制 采用尾靜脈高壓水動(dòng)力注射方法[10]。pcDNA 3.1-HBV1.3或 pcDNA3.1質(zhì)粒約40 μg溶于1.5 ml PBS中，將鼠尾置于60℃溫水中數(shù)秒，以0.4 ml/s的速度將質(zhì)粒溶液注入小鼠尾靜脈。于注射后各時(shí)間點(diǎn)，摘眼球取血，分離血清，檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg、ALT及 TB。以此來確定模型是否構(gòu)建成功。

1.2.2 血清HBsAg、HBeAg及ALT、TBiL的檢測(cè)均送往重慶醫(yī)科大學(xué)附二院檢測(cè)。血清HBsAg、HBeAg用羅氏電化學(xué)發(fā)光法分析，結(jié)果用COI(cutoff index)表示，＞1 COI為陽性。肝功能(ALT、TBiL)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.3 小鼠肝臟組織HBsAg及HBcAg的檢測(cè) 用酶免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝臟組織石蠟切片中HB-sAg及HBcAg的表達(dá)。收集正常對(duì)照小鼠、pHBV組小鼠的右葉肝臟，固定于10%的中性甲醛液中，直接送于重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室進(jìn)行石蠟切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次，逐級(jí)酒精水化，3%雙氧水去非特異性染色，抗原修復(fù)，5%山羊血清封閉后，加HBsAb或HBcAb 4℃過夜，加聚合物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化脫色，最后脫水、透明及封片，鏡檢。計(jì)數(shù)每高倍視野下(×400倍)陽性著色(棕色)的肝細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽性率。

1.2.4 肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離 用乙醚麻醉小鼠，用PBS經(jīng)肝門靜脈灌注去肝內(nèi)殘留血液，剪下肝臟并用PBS清洗后剪碎，加入10 ml消化液(含0.05%膠原酶Ⅳ及0.01%DNA酶Ⅰ的 RPMI1640液)，37℃水浴消化30 min，期間不停用吸管吹打，然后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，500 r/min離心去沉淀(含肝細(xì)胞等)，再1 800 r/min離心收集沉淀細(xì)胞(含淋巴細(xì)胞等)，經(jīng)33%percoll液2 500 r/min密度梯度離心后，去掉所有上層液體，留沉淀細(xì)胞，加入0.75%NH4Cl溶解紅細(xì)胞，再經(jīng)FACS buffer(含1%胎牛血清的PBS)洗滌后，即得肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞。

1.2.5 脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離 用兩張玻片相互擠壓磨碎脾臟，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，1 800 r/min離心收集沉淀細(xì)胞(含淋巴細(xì)胞等)，加入0.75%NH4Cl溶解紅細(xì)胞，再經(jīng)FACS buffer洗滌后，即得脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞。

1.2.6 肝或脾內(nèi)γδT細(xì)胞染色及流式檢測(cè) 取肝或脾淋巴細(xì)胞2×105，加入CD16/32抗體4℃封閉10 min，再按說明書加入適量的熒光標(biāo)記抗體anti-CD3e、anti-γδ T-cell receptor、anti-CD69 或 anti-CD25，4℃孵育30 min，用 FACS buffer洗滌后，吸入專用的流式上樣管，用FACS CantoⅡ(BD Biosciences)流式儀檢測(cè)，再用BD FACSDivaTMsoftware分析軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析得到 γδT細(xì)胞、CD25+γδT 或 CD69+γδT 的比例。

1.2.7 外周血γδT細(xì)胞的檢測(cè) 小鼠摘眼球取外周靜脈血，用肝素抗凝。取抗凝血100 μl，加入CD16/32抗體4℃封閉10 min，再加入適量的熒光抗體 anti-CD3e、anti-γδ T-cell receptor、anti-CD69 或anti-CD25，4℃孵育 30 min 后，加 2 ml 1∶10 稀釋的紅細(xì)胞裂解液(FACSTMlysing solution，BD)混勻，室溫避光作用10 min，離心后，用FACS buffer洗滌，立即流式檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，得到γδT細(xì)胞、CD25+γδT或CD69+γδT的比例。

1.2.8 γδT細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè) 肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640的完全培養(yǎng)基中，加入終濃度為100 ng/ml佛波脂(PMA)、1 μg/ml離子霉素及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(0.16 μg/ml莫能霉素)，將細(xì)胞置于24孔板內(nèi)，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)作用4 h。細(xì)胞體外刺激后，用FACS buffer洗1次，加入CD16/32抗體4℃封閉10 min，用anti-TCR γδ mAb做表面染色，洗滌后，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)0.1%saponin透膜后，加入相應(yīng)體積的 anti-IFN-γ及 anti-TNF-α流式抗體做胞內(nèi)染色，4℃避光染色30 min，洗滌后，加200 μl的 FACS buffer重懸，于BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，并用BD FACSDiva 2.0軟件分析數(shù)據(jù)，獲得IFN-γ+γδT 及 TNF-α+γδT 細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用PASW Statistics18.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件作多組間均數(shù)的方差分析(F檢驗(yàn))，兩樣本均數(shù)間比較用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性HBV感染小鼠模型復(fù)制 小鼠對(duì)尾靜脈高壓水動(dòng)力注射法耐受良好，除極個(gè)別在注射后立即發(fā)生心衰死亡外，其余均能迅速恢復(fù)正常飲食與飲水，肝臟也未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)或壞死。注入HBV質(zhì)粒后，血清中的HBsAg在第1天(pHBV1d)即為陽性(33.64±14.88)COI(＞1 COI)，在第5天(pHBV5d)達(dá)高峰(146.92±24.23)COI，隨即降低，到第15天(pHBV15d)仍為陽性(圖1A);血清HBeAg水平在第1天即達(dá)高峰(2.26±2.34)COI，為陽性，并隨著時(shí)間的推移迅速降低，第10天(pHBV10d)為陰性(＜1 COI，圖1B)。同時(shí)，HBV質(zhì)粒小鼠血清中的ALT水平在第1天上升至300U/L，隨后迅速下降至正常，而TBiL水平一直保持正常，未見升高。正常對(duì)照小鼠與pcDNA對(duì)照質(zhì)粒小鼠的外周血中HBV標(biāo)志物一直為陰性。pcDNA質(zhì)粒注射第一天小鼠的ALT水平升至80 U/L，隨即降低到正常水平。

同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)了pHBV1d、pHBV5d及正常對(duì)照(NC)小鼠肝臟組織內(nèi)HBsAg與HBcAg的表達(dá)，見圖2。圖中顯示，pHBV1d小鼠中表達(dá)HB-sAg或HBcAg的肝細(xì)胞達(dá)10% ～20%左右，HBsAg陽性細(xì)胞數(shù)高于HBcAg陽性細(xì)胞數(shù)。而pHBV5 d小鼠表達(dá)HBsAg或HBcAg的肝細(xì)胞迅速降低，僅有1%～3%左右，HBsAg主要表達(dá)于胞漿，而HB-cAg胞漿胞核均有表達(dá)。

圖1 HBV質(zhì)粒(pHBV)急性轉(zhuǎn)染小鼠模型血清中HBsAg(A)及HBeAg(B)的時(shí)間變化曲線(＞1 COI為陽性)Fig．1 The time variation curve of HBsAg(A)or HBeAg(B)in the serum of mice hydrodynamic injected with pcDNA3．1-HBV1．3 plasmid(positive when higher than 1 COI)

圖2 正常對(duì)照小鼠(NC)、HBV質(zhì)粒注射1天(pHBV1d)與5天(pHBV5d)小鼠的肝臟組織內(nèi)HBsAg與HB-cAg的表達(dá)(DAB顯色，×200倍)Fig．2 The HBsAg or HBcAg expression in liver tissue from NC，pHBV1d，or pHBV5d mouse by immunohistochemistry staining(×200 multiple)

圖3 小鼠肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞的流式檢測(cè)圖(圖中比例表示γδT細(xì)胞占T細(xì)胞中的比例)Fig．3 The FACS figures of γδT cells in murine liver，spleen or blood(the values in the figure represent the proportion of γδT cells in T cells)

2.2 急性HBV感染小鼠模型中肝臟、脾臟及外周血γδT細(xì)胞比例的變化 用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了小鼠肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞占T細(xì)胞中的比例(圖3)，結(jié)果顯示正常對(duì)照小鼠(NC)肝臟中的γδT細(xì)胞比例(4.5±0.6)%明顯高于脾臟(2.1±0.3)%或外周血(1.2±0.6)%，差異有顯著性(P＜0.01)。在HBV質(zhì)粒(pHBV)急性轉(zhuǎn)染小鼠后的第1天(pHBV1d)，肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞的比例即刻升高至(8.3±4.3)%，然后隨時(shí)間的推移而逐漸降低，但到第10天時(shí)，γδT細(xì)胞的比例又快速升高至(8.0±1.2)%，而后又下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，pHBV1d小鼠肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞比例明顯高于NC、pHBV5d、pHBV15d天的比例，差異有顯著性(P＜0.05)。但各時(shí)間點(diǎn)脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例未見有明顯的變化，組間的差異無顯著性(P＞0.05，圖4)。在 pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒注射后，小鼠肝臟、脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例均未見有顯著性的變化發(fā)生(P＞0.05，圖5)。

圖4 水動(dòng)力法注射小鼠HBV質(zhì)粒(pHBV)后肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞比例變化的時(shí)間曲線Fig．4 Time variation curve of the proportion of γδT cells in the liver，spleen or peripheral blood of mice with hydrodynamic injection of pcDNA3．1-HBV1．3 plasmid

圖5 pcDNA3．1質(zhì)粒注射小鼠后肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞比例的時(shí)間變化曲線Fig．5 Change in the proportion of γδT cells in the liver，spleen or peripheral blood of mice injected with pcDNA3．1 plasmid

圖6 小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)CD25+或CD69+的γδT細(xì)胞流式檢測(cè)圖(圖中比例表示CD25+或CD69+γδT細(xì)胞占γδT細(xì)胞中的比例)Fig．6 FACS figure of CD25+or CD69+ γδT cells in murine liver(the values in the figure represent the proportion of CD25+or CD69+ γδT cells in γδT cells)

2.3 肝臟中γδT細(xì)胞的激活表型在急性HBV感染小鼠模型中的變化 檢測(cè)了正常對(duì)照小鼠(NC)及HBV 質(zhì)粒注射小鼠(pHBV)后第1、5、10、15天肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的激活表型分子CD25與CD69(流式檢測(cè)圖見圖6)。CD69陽性的γδT細(xì)胞比例在NC肝臟中為(9.9±2.7)%，而在pHBV小鼠中CD69+γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，到第15天比例又逐漸回升。而肝臟內(nèi)CD25+γδT細(xì)胞比例在pHBV質(zhì)粒注射后第5天達(dá)到最高值(8.4±3.7)%，與血清中HBsAg水平達(dá)高峰時(shí)間一致，然后比例隨著時(shí)間而降低(圖7)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，pHBV模型組小鼠第10天的CD69+γδT細(xì)胞比例與其他組比較差異有顯著性(P＜0.05)，而各時(shí)間點(diǎn)下表達(dá)CD25分子γδT細(xì)胞的比例差異無顯著性，P＞0.05。

圖7 肝臟內(nèi)CD25或CD69陽性的γδT細(xì)胞比例在急性HBV質(zhì)粒(pHBV)轉(zhuǎn)染小鼠模型中的變化Fig．7 Change in the proportion of CD25 or CD69 positive γδT cells in the liver of mice injected with HBV plasmid

圖8 小鼠肝臟內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ或TNF-α的γδT細(xì)胞流式檢測(cè)圖(圖中比例表示 IFN-γ+或 TNF-α+γδT細(xì)胞占γδT細(xì)胞中的比例)Fig．8 FACS figures of IFN-γ+or TNF-α+ γδT cells in murine liver(the values in the figure represent the proportion of IFN-γ+or TNF-α+γδT cells in γδT cells)

圖9 肝臟內(nèi)IFN-γ或TNF-α陽性的γδT細(xì)胞比例在急性HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠模型中的變化Fig．9 Change in the proportion of IFN-γ or TNF-α positive γδT cells in the liver of mice injected with HBV plasmid

2.4 肝臟內(nèi)產(chǎn)生 IFN-γ或TNF-α細(xì)胞因子的γδT細(xì)胞比例在急性HBV感染小鼠模型中的變化 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了正常對(duì)照小鼠(NC)、pHBV模型小鼠1、5、10 d 肝臟內(nèi) IFN-γ+或 TNF-α+γδT 細(xì)胞比例(流式檢測(cè)圖見圖8)。pHBV質(zhì)粒尾靜脈注射后第1天產(chǎn)生的 IFN-γ的 γδT細(xì)胞比例升高至(8.6±3.2)%，之后即刻降低至正常對(duì)照水平。而TNF-α陽性的γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間而緩慢上升(圖9)。統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，pHBV1天的IFN-γ+或TNF-α+γδT細(xì)胞比例與其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論

HBV病毒主要感染肝細(xì)胞，肝臟內(nèi)富含淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，它們與抗HBV免疫及肝細(xì)胞免疫炎癥密切相關(guān)。其中非特異性免疫細(xì)胞包括NK、NKT及γδT細(xì)胞總量可占肝臟淋巴細(xì)胞的一半以上，因此在與HBV感染相關(guān)的免疫機(jī)制中非常重要[4-6]。

γδT細(xì)胞是一類除NK、NKT等細(xì)胞外的天然免疫細(xì)胞，參與了多種細(xì)菌與病毒的免疫應(yīng)答[7-9]。Ajuebor等[11]的報(bào)道顯示，在由腺病毒引起的小鼠肝臟炎性損傷過程中，γδT細(xì)胞是肝細(xì)胞免疫損傷的關(guān)鍵因素。Barcy等[12]也發(fā)現(xiàn)，在慢性人皰疹病毒8型感染中，γδT細(xì)胞的比例及功能均增強(qiáng)。Tseng等[13]研究γδT細(xì)胞與慢性丙型肝炎的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，患者肝組織的γδT細(xì)胞比例增加，功能增強(qiáng)，與肝組織的免疫病理密切相關(guān)。而目前有關(guān)γδT細(xì)胞在HBV感染中的作用還不怎么清楚，我們?cè)谇捌诘难芯恐兄饕^察了HBV感染患者外周血中γδT細(xì)胞比例與表型的變化[14]，因此本文以急性HBV感染小鼠作模型，著重觀察肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的比例、激活表型及細(xì)胞因子表達(dá)的變化，以期了解γδT細(xì)胞在HBV感染免疫反應(yīng)中的作用。

由于目前HBV自然感染模型僅限于黑猩猩等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，而無法在普通實(shí)驗(yàn)室復(fù)制。因此我們參照Yang等[10]方法，利用尾靜脈高壓水動(dòng)力注射原理，直接將HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠肝臟，可使HBV質(zhì)粒在肝細(xì)胞中復(fù)制與抗原表達(dá)，從而模擬機(jī)體的HBV急性感染清除的過程。我們?cè)贖BV質(zhì)粒注射后的不同時(shí)間檢測(cè)了HBsAg或HBeAg在血清中的水平，結(jié)果顯示，HBsAg可在肝細(xì)胞中高效表達(dá)并分泌至血液中，第1天即為陽性，并在第五天達(dá)高峰，而HBeAg在第1天為陽性，隨之下降，并維持于0.5 COI～0.9 COI之間。而對(duì)照pcDNA3.1質(zhì)粒注射后，HBsAg(0.733±0.366 COI)與 HBeAg(0.091±0.017 COI)均為陰性。同時(shí)我們用免疫組化法檢測(cè)了HBV質(zhì)粒小鼠肝組織內(nèi)HBsAg與HB-cAg的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)第1天小鼠肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)(陽性率為10% ～20%左右)，而到第5天降低至僅有1% ～3%左右。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞內(nèi)HBV抗原消失時(shí)間早于血清中的，這與HBV抗原具有一定半衰期有關(guān)。結(jié)果也證明，經(jīng)水動(dòng)力法注射HBV質(zhì)粒，可使HBV在肝細(xì)胞內(nèi)得以感染與抗原表達(dá)。因此，小鼠急性HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染清除模型構(gòu)建成功。但Yang[10]的結(jié)果顯示，HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第1天 HB-sAg及HBeAg水平均達(dá)高峰，隨后降低，而我們的模型中HBsAg水平在第5天才達(dá)高峰，可能與所選的小鼠品系及質(zhì)粒載體有關(guān)系。

首先，我們觀察了模型肝臟、脾臟及外周血內(nèi)γδT細(xì)胞的比例在HBV質(zhì)粒注射后的不同時(shí)間下的變化，結(jié)果顯示，在HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第1天，肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞比例立即升高，而脾中的比例降低，外周血中的比例略升高。之后，γδT細(xì)胞比例降低，而到第10天，比例又升高。結(jié)果提示在注射后第1天，由于HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞瞬間表達(dá)大量的HBV抗原，并且由于尾靜脈高壓注射引起肝細(xì)胞膜暫時(shí)性通透性增加，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，因此可引起大量免疫細(xì)胞向肝臟的聚集。由于γδT細(xì)胞作為一種非特異性免疫細(xì)胞，具有在短時(shí)間內(nèi)迅速遷移至機(jī)體損傷部位而發(fā)生炎癥或修復(fù)反應(yīng)的特性，因此，在HBV質(zhì)粒注射后第1天，γδT細(xì)胞即可反應(yīng)性地從脾臟或血中向肝臟內(nèi)聚集，從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞比例的增高。而后，其他免疫細(xì)胞在肝臟內(nèi)逐漸增多，且γδT細(xì)胞在免疫反應(yīng)過程中有一定的損傷與消耗，而使比例降低，隨著時(shí)間推移，γδT細(xì)胞可發(fā)生一定的增殖或遷移性補(bǔ)充而使比例再次升高。而脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例未發(fā)生顯著性的變化。同時(shí)，我們課題組的其他成員還檢測(cè)了HBV質(zhì)粒小鼠肝臟中NK、CD4+T及CD8+T細(xì)胞比例的變化。發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞(占肝淋巴細(xì)胞比例)也是在第1天較正常小鼠(17.8±5.4)%急劇升高，為(33.7±4.1)%，隨后迅速下降，第10天降至正常小鼠水平。而肝內(nèi)CD4+T或CD8+T細(xì)胞比例(占肝T細(xì)胞比例)至第5天才分別下降或上升到最高水平。結(jié)果顯示，NK或γδT等非特異性免疫細(xì)胞可對(duì)外來抗原迅速作出反應(yīng)，是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的第一線。

接著，我們又觀察了肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞激活分子CD69及CD25的表達(dá)，以及產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ或TNF-α的情況。結(jié)果顯示，CD69分子的表達(dá)在前10天呈下降，而在第15天，表達(dá)又增高;相反，CD25+γδT比例在第5天升高至高峰，與HBsAg在血清中的高峰時(shí)間一致，而后又降低。兩種激活分子的表達(dá)呈現(xiàn)了相反的變化規(guī)律。結(jié)果提示，可能肝內(nèi)已存在的CD69+γδT細(xì)胞因被消耗而使比例降低，但CD25分子卻為HBV感染后激活γδT細(xì)胞而產(chǎn)生，因此，γδT細(xì)胞的CD25激活分子的表達(dá)增加。而γδT細(xì)胞在激活狀態(tài)可分泌TNF-α或IFN-γ等多種細(xì)胞因子，與多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致。

因此，本文初步提示了，γδT細(xì)胞在急性HBV感染小鼠模型中早期即可比例升高，接著出現(xiàn)激活分子增加，細(xì)胞因子產(chǎn)生增強(qiáng)的過程，結(jié)果揭示了γδT細(xì)胞可能參與了HBV急性感染與清除的過程。

[1]Liang TJ.Hepatitis B:the virus and disease[J].Hepatology，2009，49(5 Suppl):S13-S21.

[2]Liaw YF，Chu CM.Hepatitis B virus infection[J].Lancet，2009，373(9663):582-592.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].中華內(nèi)科雜志，2006，45(2):162-170.

[4]Vivier E，Tomasello E，Baratin M，et al.Functions of natural killer cells[J].Nat Immunol，2008，9(5):503-510.

[5]Welsh RM，Waggoner SN.NK cells controlling virus-specific T cells:Rheostats for acute vs.persistent infections[J].Virology，2013，435(1):37-45.

[6]Dong Z，Wei H，Sun R，et al.The roles of innate immune cells in liver injury and regeneration[J].Cell Mol Immunol，2007，4(4):241-252.

[7]Bonneville M，O'Brien RL，Born WK.Gammadelta T cell effector functions:a blend of innate programming and acquired plasticity[J].Nat Rev Immunol，2010，10(7):467-478.

[8]Born WK，Yin Z，Hahn YS，et al.Analysis of gamma delta T cell functions in the mouse[J].J Immunol，2010，184(8):4055-4061.

[9]Casetti R，Martino A.The plasticity of gamma delta T cells:innate immunity，antigen presentation and new immunotherapy[J].Cell Mol Immunol，2008，5(3):161-170.

[10]Yang PL，Althage A，Chung J，et al.Hydrodynamic injection of viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virus infection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(21):13825-13830.

[11]Ajuebor MN，Jin Y，Gremillion GL，et al.Gammadelta T cells initiate acute inflammation and injury in adenovirus-infected liver via cytokine-chemokine cross talk[J].J Virol，2008，82(19):9564-9576.

[12]Barcy S，De Rosa SC，Vieira J，et al.Gamma delta+T cells involvement in viral immune control of chronic human herpesvirus 8 infection[J].J Immunol，2008，180(5):3417-3425.

[13]Tseng CT，Miskovsky E，Houghton M，et al.Characterization of liver T cell receptor gammadelta T cells obtained from individuals chronically infected with hepatitis C virus(HCV):evidence for these T cells playing a role in the liver pathology associated with HCV infection[J].Hepatology，2001，33(5):1312-1320.

[14]Chen M，Zhang D，Zhen W，et al.Characteristics of circulating T cell receptor gamma-delta T cells from individuals chronically infected with hepatitis B virus(HBV):an association between V(delta)2 subtype and chronic HBV infection[J].J Infect Dis，2008，198(11):1643-1650.