香連丸有效部位對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

陳兆群，蔡蔚斌，陳懷，陳展祥，方少虹

1.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515031；2.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 汕頭 515031；3.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院外科，廣東 汕頭 515031

“腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一”這一論點(diǎn)越來(lái)越受人們的公認(rèn)。目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)已有香連丸有效部位具有抗消化性潰瘍潰瘍[1-3]、抑制胃酸分泌、解痙、抗菌[4]、抗腹瀉[5]、抑制小腸推進(jìn)、抗炎[6]等作用等藥理作用。但國(guó)內(nèi)卻鮮有關(guān)于香連丸有效部位對(duì)腸保護(hù)作用的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究香連丸有效部位對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用，初步分析其作用途徑及機(jī)制，為臨床防治腸炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用體重2～3kg的清潔級(jí)雄性新西蘭兔45只，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供，屏障系統(tǒng)個(gè)別籠養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組 將所選家兔隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(I組)、模型對(duì)照組(Ⅱ組)和香連丸組(Ⅲ組)，每組15只。3組家兔術(shù)前12h禁食，禁水4h，清洗動(dòng)物，備皮。動(dòng)物稱重后耳緣靜脈給予鹽酸氯胺酮(上海第一生化藥業(yè)有限公司)20～25mg/kg，分離頸內(nèi)靜脈插管。3組動(dòng)物按無(wú)菌操作原則取上腹正中切口4～5cm，輕輕翻出十二指腸。Ⅰ組動(dòng)物放回十二指腸，逐層關(guān)閉腹腔。Ⅱ-Ⅲ組動(dòng)物在膽總管結(jié)合點(diǎn)上游約1cm處鈍性分離膽總管，用4號(hào)絲線提起并結(jié)扎膽總管，回納組織后，逐層關(guān)閉腹腔。3組動(dòng)物均禁食12小時(shí)后開(kāi)放飲食，Ⅱ組給予香連丸有效部位(萸黃連總生物堿和木香揮發(fā)油)。萸黃連生物堿從毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch(吳茱萸制)中提取，總生物堿含量達(dá)50%以上，木香揮發(fā)油是從菊科植物云木香Aucklangia lappa Decne中提取，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量之和達(dá)50%。香連丸組大鼠每天灌胃1.168g/kg，Ⅰ組和Ⅲ組動(dòng)物每天灌胃同體積生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集及預(yù)處理 三組動(dòng)物于術(shù)前及術(shù)后72h取血后處死。血漿分離保存于-70℃冰箱內(nèi)待檢測(cè)。取距回盲部約5cm處回腸組織，沿縱軸剪開(kāi)腸管，清洗腸內(nèi)容物，濾紙吸干水后福爾馬林溶液固定。1.4 血膽紅素水平檢測(cè) 用GAMSTAR 自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)產(chǎn))測(cè)定血清總膽紅素和直接膽紅素，部分結(jié)扎膽總管后引起明顯的高膽紅素血癥，檢驗(yàn)梗阻性黃疸模型是否建立成功。

1.5 血漿內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測(cè)定。

1.6 小腸黏膜HE染色圖片 小腸組織切片后行HE染色，由病理科醫(yī)師觀察病理學(xué)變化并采用Chiu氏6級(jí)評(píng)分法行病理評(píng)分[7]，光鏡下觀察腸黏膜形態(tài)變化。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行管理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)術(shù)前術(shù)后計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 血膽紅素測(cè)定結(jié)果 假手術(shù)組動(dòng)物手術(shù)前后血清總膽紅素和直接膽紅素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型對(duì)照組和香連丸組動(dòng)物術(shù)后72h血清總膽紅素和直接膽紅素均較手術(shù)前顯著升高(P<0.01)，并且與假手術(shù)組動(dòng)物比較也顯著升高(P<0.01)，達(dá)到中度黃疸水平(見(jiàn)表1)。

表1 三組術(shù)前、后血清總膽紅素水平(±s)對(duì)比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

表1 三組術(shù)前、后血清總膽紅素水平(±s)對(duì)比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與手術(shù)前比較，##P<0.01。

組別 血清總膽紅素/mmol/L 血清直接膽紅素/mmol/L術(shù)前 術(shù)后72 h 術(shù)前 術(shù)后72 h假手術(shù)組 2.84±0.80 2.93±0.96 2.13±0.73 2.16±0.85模型對(duì)照組 2.89±0.78 24.5±9.59**,## 2.15±0.82 16.73±8.41**,##香連丸組 2.76±0.75 22.5±8.68**,## 2.20±0.93 14.86±8.96**,##

2.2 小腸組織病理學(xué)檢查 本實(shí)驗(yàn)使用Chiu氏病理評(píng)分法，共有6級(jí)：0級(jí)為正常小腸黏膜絨毛；1級(jí)為在絨毛中軸出現(xiàn)腸黏膜上皮下的Gruenhagen's間隙，常常伴隨毛細(xì)血管充血；2級(jí)為來(lái)自固有膜的腸黏膜上皮抬高以及腸上皮下間隙的擴(kuò)張，3級(jí)為大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側(cè)倒伏，部分絨毛頂端脫落；4級(jí)為絨毛及固有膜脫落，裸露的毛細(xì)血管擴(kuò)張，可看到固有膜細(xì)胞成分構(gòu)成增加：5級(jí)為固有膜蛻變或被消化，出血或潰瘍形成。光鏡觀察下(見(jiàn)圖1)，假手術(shù)組chiu氏0級(jí)15只；模型對(duì)照組小腸黏膜chiu氏3級(jí)共3只，Chiu氏評(píng)分4級(jí)共12只；香連丸組小腸黏膜chiu氏1級(jí)共1只，chiu氏2級(jí)共12只，chiu氏3級(jí)共2只。兩組小腸組織病理學(xué)分級(jí)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 三組小腸組織病理學(xué)分級(jí)對(duì)比Tab 2 Small intestine histopathological grading before and after surgery in three groups

2.3 對(duì)兔血中二胺氧化酶(DAO)及血清內(nèi)毒素的測(cè)定及影響 假手術(shù)組動(dòng)物手術(shù)前后血清DAO和內(nèi)毒素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型對(duì)照組和香連丸組動(dòng)物術(shù)后血清DAO和內(nèi)毒素水平均較手術(shù)前顯著升高(P<0.01)，但是香連丸組術(shù)后血清DAO和內(nèi)毒素水平均較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表3。

3 討論

梗阻性黃疸對(duì)腸黏膜屏障的破環(huán)機(jī)制極其復(fù)雜，它包括阻黃對(duì)腸黏膜屏障的機(jī)械、細(xì)菌、免疫、化學(xué)屏障和腸肝軸的破壞，其中又包含腸緊密連接的改變、腸道細(xì)胞增生與凋亡的失衡、氧化應(yīng)激、腸道細(xì)菌失調(diào)等眾多因素的參與。姚晉林等[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸時(shí)末端回腸黏膜發(fā)生萎縮、絨毛水腫和部分上皮細(xì)胞脫落，這些改變削弱了腸黏膜的屏障功能，腸道菌群從破損的腸黏膜進(jìn)入內(nèi)臟，導(dǎo)致細(xì)菌移位的發(fā)生，說(shuō)明腸道細(xì)菌移位在梗阻性黃疸病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。血二胺氧化酶(DAO)是一種含有脫氨的腐胺和組胺的細(xì)胞內(nèi)酶，可將腐胺氧化為氨基丁醛，并進(jìn)一步環(huán)化成一種吡咯啉，是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。小腸黏膜屏障功能衰竭時(shí)，腸黏膜細(xì)胞脫落入腸腔，DAO進(jìn)入腸淋巴管和血流，使血中DAO升高。因此，血中DAO活性可反映腸道損傷和修復(fù)情況[9]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜上的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和微量蛋白質(zhì)的復(fù)合物，LPS是它的主要抗原性及致病性部分，在機(jī)體免疫力下降等情況下腸道內(nèi)的致病菌，特別是革蘭陰性菌就會(huì)大量生長(zhǎng)、繁殖并釋放大量的內(nèi)毒素，可直接引起腸黏膜屏障損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎膽總管使兔產(chǎn)生梗阻性黃疸，使兔血清內(nèi)毒素及血二胺氧化酶較術(shù)前明顯上升，達(dá)到病理意義，且通過(guò)光鏡確認(rèn)家兔回腸黏膜出現(xiàn)損傷。試驗(yàn)中香連丸組給予香連丸有效部位灌腸，而對(duì)照組給予生理鹽水灌腸，結(jié)果香連丸組血二胺氧化酶(DAO)、血清內(nèi)毒素(ET)的含量較模型組明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明香連丸能有效的保護(hù)腸黏膜屏障，這可能與香連丸強(qiáng)效的抑菌作用有關(guān)。香連丸有效成分能有效抑制腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)，減少細(xì)菌異位的發(fā)生可能[11]。此外，香連丸有效部位有抑制腸蠕動(dòng)、減少腸液、胃酸分泌的作用，從而使本來(lái)減弱的腸黏膜屏障得到加固，起到抗炎的作用[12]。

表3 三組術(shù)前、后血清DAO及內(nèi)毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

表3 三組術(shù)前、后血清DAO及內(nèi)毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與手術(shù)前比較，##P<0.01。

組別 血清DAO/ku/L 血清內(nèi)毒素/pg/mL術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后假手術(shù)組 0.78±0.24 0.83±0.35 0.83±0.31 0.85±0.38模型對(duì)照組 0.76±0.34 1.43±0.42**,## 24.60±3.59**,## 130.0±18.9**,##香連丸組 0.79±0.32 1.02±0.37**,##,&& 23.96±4.84**,## 65.5±23.7**,##,&&

圖1 術(shù)后各組腸黏膜形態(tài)變化Fig 1 Histopathological changes in the three groups after the surgery

綜上所述， 香連丸有效部位對(duì)兔梗阻性黃疸腸黏膜損傷有明顯的治療作用，可減輕腸道炎癥反應(yīng)，對(duì)腸黏膜起到保護(hù)作用，臨床上可用于對(duì)腸炎的治療，但關(guān)于其機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

[1] 王海,肖洪彬.香連丸治療消化性潰瘍拆方實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息,2005,22(4):86.

[2] 李心.香連顆粒的臨床藥理研究[J].首都醫(yī)藥,1998,5(7):31.

[3] 常向明,劉小平,姚垂宇,等.香連丸聯(lián)用TMP抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房,1995,6(4):16.

[4] 張文新,譚曉梅.香連丸有效部位對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(12):170-173.

[5] 曹毓,張磊,彭龍玲,等.精制香連膠囊抗實(shí)驗(yàn)性腹瀉研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2000,11(3):200.

[6] 譚曉梅,龍群,等.香連丸有效部位鎮(zhèn)痛、止瀉、抗炎及小腸推進(jìn)的藥效學(xué)研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,23(3):499.

[7] Kuru B,Dinc S,Altinok G, et al. Effect of different enteral nutrients on bacterial translocation in experimental obstructive jaundice[J].Eur Surg Res,2004,36(1):45-52.

[8] 姚晉林,閆軍,王世民,等.梗阻性黃疸與腸黏膜屏障功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(3):248-250.

[9] 趙灝,李曉歐,婁國(guó)強(qiáng),等.病毒性肝炎后肝硬化患者腸道的通透性[J].中華傳染病雜志,2002,20(2):105-107.

[10] 高金生,時(shí)志民,韓轉(zhuǎn)葉,等.肝硬化腸黏膜屏障損傷患者血漿D-乳酸、二胺氧化酶及內(nèi)毒素的變化[J].臨床薈萃,2009,24(3):119-221.

[11] 張友菊,熊素華,周邦靖.香連丸等四種方劑及其組成藥物抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川中醫(yī),1999,17(9):9-10.

[12] 李麗萍,劉環(huán)清,張淑清,等.香連丸抗消化性潰瘍作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2012,40(2):43-46.