李 達(dá),湯德元,李春燕,羅險(xiǎn)峰,曾智勇,劉 建,郝 飛,王洪光
(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽(yáng) 550008)
2014年3月,貴州省開陽(yáng)縣某規(guī)?;i場(chǎng)送檢斷奶仔豬10頭,其中4頭死亡,6頭病危,1 d后其余病危的6頭相繼死亡。為了了解該豬場(chǎng)疫病的感染狀況,對(duì)該規(guī)?;i場(chǎng)送檢的發(fā)病仔豬進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細(xì)菌學(xué)和PCR技術(shù)診斷,確診為豬偽狂犬病和豬大腸桿菌混合感染。報(bào)告如下。
該豬場(chǎng)斷奶仔豬未免疫豬偽狂犬病疫苗,發(fā)病突然,1~3 d共計(jì)有80頭斷奶仔豬發(fā)病,死亡36頭,病豬發(fā)熱,體溫升高到40.0℃~41.0℃,精神沉郁,食欲不振,喘氣,被毛粗亂,血液稀薄。發(fā)病后豬場(chǎng)曾使用青霉素、鏈霉素等抗生素進(jìn)行治療,病豬體溫有所降低,但發(fā)病后2~3 d死亡。
病豬主要癥狀是脫水和下痢,黃痢仔豬排黃色稀便,急性病例不見癥狀而昏迷死亡。白痢仔豬排出乳白色漿液狀、糊狀糞便。隨著病情的發(fā)展,出現(xiàn)食欲廢絕,有的眼屎多、眼瞼紅腫,眼圈發(fā)紫、結(jié)膜潮紅,有的病豬尖叫、磨牙,有的病豬耳朵發(fā)青、發(fā)紫、身體發(fā)紺,有的病豬出現(xiàn)呼吸困難,最后窒息死亡。
剖檢病理可見喉頭、扁桃體充血、皮下組織水腫;腸系膜淋巴結(jié)和下領(lǐng)淋巴結(jié)充血、腫大,間有出血;肺部有局灶性炎癥,并伴有充血、出血、淤血條紋和水腫,切開有泡沫;肝臟邊緣呈紫黑色、表面有許多散在的、顆粒狀大小不一的白色壞死斑點(diǎn);腎臟表面有針尖大小出血點(diǎn),腎臟切面有散在壞死點(diǎn)。
3.1 豬偽狂犬病ELISA初步檢測(cè)血樣 應(yīng)用豬偽狂犬病ELISA試劑盒對(duì)抽取的10份血清進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明,由于該規(guī)?;i場(chǎng)未接種偽狂犬病疫苗,根據(jù)送檢的10頭仔豬血樣采集進(jìn)行的ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)80%,從而初步診斷該規(guī)模化豬場(chǎng)存在PRV感染。
3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 無(wú)菌采集取病死豬的肝、肺、腎、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)病料同時(shí)進(jìn)行接種普通瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上,置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)24~48 h后。淋巴結(jié)接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成直徑約2 mm的圓形、光滑、隆起、濕潤(rùn)、半透明淡灰色的菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成較大的呈光滑、濕潤(rùn)、圓形、隆起的粉紅色菌落,部分菌株在血液瓊脂平板上呈β溶血環(huán)。用接種棒挑取可疑菌落制成涂片進(jìn)行革蘭染色,通過(guò)涂片鏡檢為兩端鈍圓的短小桿菌,偶有2~3個(gè)菌體相連,為革蘭陰性桿菌,符合大腸桿菌形態(tài)特性。
3.3 生化特性鑒定 將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管中,置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后,生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明,該分離株對(duì)硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對(duì)照、棉子糖、側(cè)金盞花醇、木膠糖12種發(fā)酵管反應(yīng)呈陽(yáng)性,對(duì)葡磷胨水、山梨醇2種發(fā)酵管反應(yīng)呈陰性。其他生化試驗(yàn)中,吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性,V-P試驗(yàn)陰性,枸櫞酸酸鹽利用試驗(yàn)呈陰性,七葉苷水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性,均符合大腸桿菌生化特性。
3.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法(disc agar diffusion),即(K-B法)操作。用接種環(huán)挑取1~2環(huán)純培養(yǎng)的分離菌,接種于含5%脫纖綿羊血的M-H瓊脂培養(yǎng)基上涂勻,選取12種常用藥敏紙片均勻地貼到培養(yǎng)基上,置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后觀察結(jié)果,測(cè)定抑菌圈直徑。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,從該豬場(chǎng)分離的病原菌對(duì)頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平高敏;對(duì)鏈霉素和妥布霉素中敏;而對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星和四環(huán)素已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。
3.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取血液瓊脂平板上培養(yǎng)的24 h菌落制成細(xì)菌懸液(CFU為5×108個(gè)∕mL),分別取0.5 mL采取腹腔注射接種在生長(zhǎng)條件相同的10只小鼠,對(duì)照組10只注射等量生理鹽水。結(jié)果接種了分離菌的小鼠均在24~48 h內(nèi)死亡,對(duì)照組沒有死亡。無(wú)菌取死亡小鼠的心臟、肝臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,結(jié)果經(jīng)分離提純后鑒定,與以上特性相一致,確診為有大腸桿菌參與的混合感染。
3.6 PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank中PRV GDSH株(E F552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的糖蛋白gE基因主要抗原表位序列,設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(P1、P2),預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為652 bp,擴(kuò)增引物序列為(下劃線表示限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)):P1:5′-CGGGATCCGCCGACGACGATGACCTCAAC-3′,P2:5′-CGGAATTCCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3′。PCR反應(yīng)采用25 μL體系:其中ddH2O 5 μL,2×GC BufferⅠ12.5 μL,dNTP 4.0 μL,上下游引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,Taq酶0.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃4 min;95℃1.5 min,58℃0.5 min,72℃1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。對(duì)疑似PRV感染的病料進(jìn)行提取病毒總DNA(按照DNA試劑盒上說(shuō)明書進(jìn)行提?。?jīng)PCR擴(kuò)增后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳得到1條652 bp的片段,陰性對(duì)照未見條帶(見圖1)。測(cè)序后與預(yù)期結(jié)果相符,這說(shuō)明送檢的病料確診為有PRV的混合感染。
通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢診斷及豬偽狂犬病ELISA檢測(cè),初步診斷該規(guī)?;i場(chǎng)斷奶仔豬疑似豬偽狂犬病病毒和大腸桿菌混合感染。通過(guò)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化特性、培養(yǎng)特性及動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定確診該細(xì)菌為大腸桿菌。PCR結(jié)果顯示,送檢病豬中檢出了PRV核酸陽(yáng)性條帶,測(cè)序后與預(yù)期結(jié)果相符,均為PRV,并且該規(guī)?;i場(chǎng)斷奶仔豬并沒有接種豬偽狂犬病病毒疫苗,表明該豬場(chǎng)已經(jīng)存在PRV感染。綜合分析以上結(jié)果,建議該規(guī)?;i場(chǎng)緊急接種豬偽狂犬病病毒疫苗,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并合理投喂抗生素避免繼發(fā)感染,同時(shí)將可疑豬和病豬全部隔離飼養(yǎng),病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋,對(duì)污染的圈舍和四周環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒,患病豬群則隔離治療并帶豬消毒,對(duì)新購(gòu)進(jìn)豬要進(jìn)行嚴(yán)格的隔離、檢疫,隔離期間定期進(jìn)行血清學(xué)抗體檢測(cè)。藥敏試驗(yàn)表明,該豬場(chǎng)在治療時(shí)可將頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。對(duì)于混合或多重繼發(fā)感染的情況,應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)癥下藥,避免亂用藥而造成的仔豬的死亡。豬偽狂犬病病毒與大腸桿菌混合感染多表現(xiàn)為急性、發(fā)病快、病程短、死亡率高,一旦發(fā)病,將帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失,加上現(xiàn)在血清型眾多、現(xiàn)有疫苗效果較差、抗菌藥物的大量使用,大腸桿菌在選擇壓力下廣泛的產(chǎn)生耐藥性。因此,規(guī)?;i場(chǎng)只有建立健全獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度,搞好日常衛(wèi)生管理工作,嚴(yán)格引種,堅(jiān)持自繁自養(yǎng),“全進(jìn)全出”,合理使用預(yù)防藥物等綜合防制措施,才能最大限度的減少疫病的發(fā)生。