李 志,王金秋,劉 朗
(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系,北京 房山 102442;2.北京伴侶動物醫(yī)院,北京 西城 100035)
白頭翁湯是中醫(yī)治療出血性胃腸炎的經(jīng)典方劑。前期研究表明,白頭翁湯對小鼠內(nèi)毒素癥有很高的保護率,白頭翁湯有效成分對內(nèi)毒素引起的微血管內(nèi)皮細胞NO分泌升高有明顯下調(diào)作用。本試驗利用中藥(生物)細胞破壁技術(shù)加工白頭翁湯微粉,研究了白頭翁湯普粉和白頭翁湯微粉對抗內(nèi)毒素作用,以期為獸醫(yī)臨床應用中藥微粉防治疾病提供理論依據(jù)。
1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(購自Gibco公司);LPS(E.coli O55:B5,購自Sigma公司);ET-1及sICAM-1試劑盒(購自R&D公司);NO試劑盒(購自晶美生物工程有限公司);七葉亭(標準品,由白求恩醫(yī)科大學中藥研究室提供)。
1.2 試驗細胞準備及處理 試驗使用第5代細胞。將融合生長的內(nèi)皮細胞以0.25%胰蛋白酶消化,細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板,細胞密度5×107cells/L,每孔 500 μL,置 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞融合成單層細胞,開始試驗。分組:(1)對照組(加含2%血清的維持培養(yǎng)基);(2)LPS組(1 μg/mL的LPS);(3)LPS+七葉亭組(分別用10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL預孵2 h后加入1 μg/mL的LPS);(4)七葉亭組(10 μg/mL七葉亭),每組設(shè)6個重復孔,分別于培養(yǎng)12 h后收集上清液,貯存于-20℃冰箱內(nèi)待測。
1.3 試驗動物及其處理 昆明系小鼠50只,分為正常對照組、內(nèi)毒素癥組、白頭翁湯煎劑組(0.3 mL)、白頭翁湯微粉2/3劑量懸液組(0.2 mL)、白頭翁湯微粉1/3劑量懸液組(0.1 mL),每組10只。小鼠腹腔注射1 mg/mL內(nèi)毒素0.2 mL,同時腹腔注射中藥制劑,觀察死亡率,24 h后小鼠用乙醚麻醉后眼眶采血,血樣用肝素抗凝(血樣:肝素(v:v)=1∶10),4℃保存待測血漿NO水平。
1.4 血清和細胞培養(yǎng)上清液NO含量測定 NO測定采用還原酶法,測試方法均參照試劑盒說明書。
通過SPSS統(tǒng)計軟件分析,白頭翁湯微粉2/3劑量組和1/3劑量組與內(nèi)毒素組相比,極其顯著地降低了內(nèi)毒素引起的內(nèi)皮細胞分泌NO的水平,與白頭翁湯普粉組相比無顯著差異(表1)。
中藥制劑傳統(tǒng)粉碎方法的藥物細胞破壁率極低,超微粉碎技術(shù)是近年來剛剛興起的一項高新技術(shù),對提高中藥藥效,提高中藥藥品質(zhì)量,降低中藥資源浪費與消耗,提高企業(yè)和社會經(jīng)濟效益,都具有十分重要的現(xiàn)實意義和應用價值[1]。已有研究表明,單味中藥和中藥復方經(jīng)超微粉碎后,能促進藥物有效成分的溶出,提高其生物利用率和藥物療效,同時節(jié)省藥材用量,使用小劑量的超微細粉就能達到大劑量傳統(tǒng)粗粉的藥效。
表1 白頭翁湯對微血管內(nèi)皮細胞分泌NO的影響(n=6,X±S)
本試驗以體外培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞為模型,建立了LPS損傷模型,研究了白頭翁湯微粉對內(nèi)毒素引起的內(nèi)皮細胞分泌NO增加的影響,結(jié)果白頭翁湯微粉2/3劑量組和1/3劑量組與內(nèi)毒素組相比,極其顯著地降低了內(nèi)毒素引起的內(nèi)皮細胞分泌NO升高,與白頭翁湯普粉組相比無顯著差異。
本試驗結(jié)果證實,白頭翁湯微粉提高療效,降低用量,和其他研究結(jié)果一致[2-4]。中藥超微粉可以提高中藥藥效、降低中藥資源的浪費與消耗,改善中草藥的適口性、提高中醫(yī)藥的研究水平,增加畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益,本試驗可為臨床應用中藥超微粉提高理論依據(jù)。
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