王偉丞,梁海英,曾智勇,湯德元,劉 釗
(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)場(chǎng),貴州 貴陽(yáng) 550025)
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。PMWS于1997年首次在加拿大報(bào)道,隨后在美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道。近年來(lái)該病在我國(guó)普遍流行,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2000年郎洪武等首次報(bào)道中國(guó)豬群存在PCV2感染,陽(yáng)性率為42.9%[2]。2007年周緒斌等報(bào)道在2000-2005年間20多個(gè)省市PCV2感染平均陽(yáng)性率達(dá)55.04%[3]。根據(jù)崔亞蘭等對(duì)貴州省2007-2011年豬圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,PCV2在貴州省的感染日益嚴(yán)重[4];另根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2011-2012年間貴州部分地區(qū)的PCV2血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),PCV2野毒感染的陽(yáng)性率高達(dá)61.3%[5]。如今PCV2及其所致的相關(guān)疾病越發(fā)嚴(yán)重,已成為研究的熱點(diǎn)。
2013年12月上旬,貴州省開(kāi)陽(yáng)縣某豬場(chǎng)10日齡左右的仔豬發(fā)生體溫升高、下痢、皮膚發(fā)紅、極度消瘦為特征的急性傳染病,并導(dǎo)致仔豬大量死亡,12月中旬該豬場(chǎng)送檢1頭病死仔豬以確定病原感染類(lèi)型,經(jīng)豬繁殖障礙性病毒性疫病6重PCR檢測(cè)方法[6]診斷為PCV2和PRRSV混合感染。為了解該毒株的分子遺傳背景,試驗(yàn)針對(duì)PCV2全基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物,對(duì)該毒株進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增、克隆和序列分析,旨在給貴州省PCV2的流行病學(xué)研究、診斷與防控、疫苗免疫等提供依據(jù)和參考。
1.1 病料來(lái)源 病料樣品系貴州省開(kāi)陽(yáng)縣某豬場(chǎng)送檢的疑似PMWS的1頭病死仔豬。
1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒,購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;LA Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、DL-2 000、pMD19-T Simple Vector,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit,OMEGA公司產(chǎn)品;普通質(zhì)粒小提試劑盒為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品;大腸桿菌感受態(tài)TOP10(貴州省動(dòng)物疫病研究室制備和保存);其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PCV2序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增全序列:
PCV2-S:5′-CCCAAGCTTCTTTTTTATCACTTC GTAATGGTTTT-3′;
PCV2-As:5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTA TTTCATATGGA-3′。
分別在引物兩端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)(劃線部分),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
1.4 病毒DNA的提取 取送檢病死仔豬淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等組織用PBS按1∶5倍稀釋研磨,制成乳懸液,-80℃反復(fù)凍融3次后,8 000 r/min離心15 min,取上清按照DNA提取試劑盒操作步驟提取病毒核酸,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 PCV2全基因組的克隆與測(cè)序 利用設(shè)計(jì)的PCR引物,以上述制備好的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:模版DNA 5.0 μL,10×LA Taq Buffer 5.0 μL,dNTP Mixture 8.0 μL,上下游引物各1μL,LA Taq 0.5 μL,ddH2O 29.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃熱變性1 min,57℃退火40 s,72℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
將3個(gè)目的基因片段按照常規(guī)方法分別克隆到pMD19-T Simple載體中,進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。
1.6 序列分析 應(yīng)用DNAStar 7.0和MEGA5.0生物學(xué)軟件對(duì)克隆的PCV2全基因組序列與Gen-Bank中查得的PCV2全基因組核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。
2.1 病料PCR的擴(kuò)增 以組織中提取的病料核酸為模版,應(yīng)用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,擴(kuò)增出1條與預(yù)期片段大小1 800 bp左右的特異性條帶(圖1)。
2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將純化的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T Simple載體,重組質(zhì)粒pMD19-TPCV2經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,均獲得大小約1 800 bp的與預(yù)期片段大小一致的DNA片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。
2.3 序列分析 測(cè)序結(jié)果表明,該毒株基因組全長(zhǎng)為1 767 bp,GenBank登錄號(hào)為KJ139962,將其命名為GZ-KY1株。與從GenBank收錄的毒株序列中選取的20株不同國(guó)家和地區(qū)的PCV2毒株進(jìn)行核苷酸序列相似性比對(duì)分析,結(jié)果表明,所有PCV2毒株之間的序列相似性均相對(duì)較高,介于94.1%~98.4%之間,其中GZ-KY1與GQ359008(上海)的毒株的相似性最高為98.4%,與EU148504(丹麥)毒株相似性最低分別為94.1%,與疫苗株LG(HM038034)和SH(AY686763)的相似性分別為95.0%和96.3%。
為了更好地了解PCV毒株的遺傳學(xué)特性及相互間親緣關(guān)系,應(yīng)用MEGA5.0軟件,以相關(guān)PCV2毒株全基因組核苷酸序列,繪制了系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)2008年歐盟豬圓環(huán)病毒疾病委員會(huì)基因分型的標(biāo)準(zhǔn)[7],可將PCV2 KJ139962-GZKY1(開(kāi)陽(yáng))株劃歸為PCV2b基因型,且貴州株JQ809463-GZ-QZ1(清鎮(zhèn))和JQ809464-GZ-RH1(仁懷)均屬于PCV2b基因型,僅JQ809462-GZCS1(長(zhǎng)順)株屬于PCV2a基因型,表明貴州地區(qū)流行的PCV2基因型以2b型為主。
PCV2相關(guān)疾病已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病,其單獨(dú)感染較少,常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒等混合感染,表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀和較高的死亡率。PCV2主要分為PCV2a,PCV2b,PCV2c三個(gè)亞型,其中PCV2a主要在歐美等國(guó)家和亞洲的日本、韓國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等;PCV2b包含了加拿大、美國(guó)、巴西、中國(guó)等;PCV2c僅在丹麥有報(bào)道。有學(xué)者認(rèn)為PCV2的不同基因型毒力不同,普遍認(rèn)為PCV2b的致病力要強(qiáng)于PCV2a,且在1998-2002年間我國(guó)流行的豬圓環(huán)病毒主要以PCV2a亞型為主,2002年以后PCV2a亞型較少,主要以PCV2b為主[8]。
本試驗(yàn)從貴州開(kāi)陽(yáng)地區(qū)疑似PMWS病料中通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了一株P(guān)CV2全基因序列。經(jīng)序列分析表明,該毒株屬于PCV2b亞型,且本實(shí)驗(yàn)室先前分離的3株P(guān)CV2毒株中,2株P(guān)CV2b亞型,1株為PCV2a亞型,表明貴州地區(qū)流行的豬圓環(huán)病毒也以PCV2b為主。與國(guó)內(nèi)外參考毒株之間的相似性在94.1%~98.4%之間,表明所有PCV2毒株之間的親緣關(guān)系均較近,基因組比較保守,但近年來(lái)我國(guó)也有PCV2基因組大小為1 766 bp的報(bào)道,這可能是PCV2變異所致[9-10],這些變異是否和毒力以及臨床癥狀有關(guān)有待進(jìn)一步研究。
目前PCV2已經(jīng)在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛存在,豬場(chǎng)對(duì)于PCV2的防控除加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外,還需要對(duì)混合感染的其他病原作適當(dāng)?shù)闹鲃?dòng)免疫和被動(dòng)免疫,預(yù)防性給藥治療控制細(xì)菌性疾病的混合感染或繼發(fā)感染,同時(shí)開(kāi)展有效的綜合性防制措施,才能起到事半功倍的效果[11]。
[1]Li W,Wang X,Ma T,et al.Genetic analysis of porcine circovirus type 2(PCV2)strains isolated between 2001 and 2009:genotype PCV2b predominate in postweaning multisystemic wasting syndrome occurrences in eastern China[J].Virus Genes,2010,40(2):244-251.
[2]郎洪武,張廣川,吳發(fā)權(quán),等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2000,30(03):3-5.
[3]周緒斌,張馨玉,許秀梅.我國(guó)豬圓環(huán)病毒2型的流行情況和分析[J].中國(guó)豬業(yè),2007(05):37-41.
[4]崔亞蘭,王開(kāi)功,張華,等.2007-2011年貴州省豬圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(03):70-73.
[5]王偉丞,曾智勇,劉志杰.貴州省幾種豬繁殖障礙性疫病抗體水平檢測(cè)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(05):118-120.
[6]劉志杰,曾智勇,湯德元,等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(09):1429-1436.
[7]Cortey M,Olvera A,Grau-Roma L,et al.Further comments on porcine circovirus type 2(PCV2)genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol,2011,149:522-523.
[8]黃新,康立超,韓猛立,等.豬圓環(huán)病毒2型XJ-SW株全基因組的克隆與序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2012,42(5):461-466.
[9]郭龍軍,陸月華,危艷武,等.我國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分離株的遺傳變異分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(11):856-859.
[10]Shang S B,Jin Y L,Jiang X T,et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2[J].Mol Immunol,2009,46(3):327-334.
[11]賈懷杰,王曉霞,房永祥,等.豬圓環(huán)病毒2型甘肅株全基因組克隆及序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,37(1):1-6.