血清HB V-DNA熒光定量PCR檢測與乙肝病毒標志物模式的相關(guān)因素探討

顏 敏

湖北省醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院十堰市人民醫(yī)院檢驗科，湖北十堰 442000

乙型肝炎是世界上最為常見的嚴重危害人類健康的傳染病，乙肝病毒(HBV)感染后可引起多種類型的急慢性肝炎，還是導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌的主要原因，也是嚴重威脅患者生命的嚴重疾病[1]，目前研究表明乙型肝炎的發(fā)病率和病死率都有上升的趨勢，在降低患者生活質(zhì)量的同時危害生命安全[2]。現(xiàn)階段對乙肝病毒感染的病理生理機制掌握上不全面，臨床癥狀及表現(xiàn)形式復(fù)雜，病情遷延導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同血清學(xué)標志物模式[3]，因此針對乙肝病毒血清標志物檢測對于臨床診斷乙肝病毒感染情況及傳染性分析，同時指導(dǎo)臨床科學(xué)治療有著重要的臨床應(yīng)用價值。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是檢測乙肝病毒血清標志物的常用方法，但是檢測率相對較低對于病毒早期感染檢測效率差[4]，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引起特異性高、靈敏性強，已經(jīng)廣泛用于病毒的檢測，尤其是實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)能準確檢測患者體內(nèi)HBV感染的具體狀態(tài)，同時能對HBV-DNA的檢測進行量化對比[5]，全面掌握病毒的復(fù)制狀態(tài)和傳染性，對于臨床診斷和提供科學(xué)治療方案有著重要作用。該研究2013年1月—2014年1月間通過血清HBV-DNA熒光定量PCR檢測與乙肝病毒標志物模式的相關(guān)因素，旨在為探討HBV－DNA含量與各種乙肝病毒標志物的關(guān)系，為進一步研究乙型肝炎病毒復(fù)制、感染性及臨床抗病毒的研制提供理論依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇該院接受乙肝治療的360例患者，其中男196例，女164例，年齡為23～69歲，平均年齡為(39.86±1.01)歲，所有患者均符合2000年第10次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議所制訂的《病毒性肝炎防治方案》中的診斷及分型標準，并排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎的重疊感染的患者，空腹采集患者血清，分離后進行分裝備用。

1.2 方法

儀器與設(shè)備：HBV-DNA熒光定量PCR檢測的試劑盒由達安基因生物工程股份有限公司提供，ELISA法乙肝血清標志物(HBVM)采用珠海麗珠有限公司乙型肝炎檢測試劑盒，在美國ABI ViiATM7實時熒光定量PCR儀上測定，科華KHB ST-360型酶標儀、安圖Iwo-960型洗板機。乙肝病毒血清標志物檢測：應(yīng)用ELISA法檢測，根據(jù)試劑盒說明書的指導(dǎo)進行操作，應(yīng)用酶標儀對結(jié)果進行讀數(shù)并記錄；HBV-DNA檢測：采用熒光定量PCR的方法，取患者血清樣本100 μL，加入100 μL DNA提取液，充分混合后用離心機12000 rpm離心10 min，棄去上清后加入 25 μL處理液，100℃水浴中預(yù)熱10 min后再離心10 min，取2 μL上清液加入PCR管，應(yīng)用PCR儀設(shè)定好正確程序進行檢測，同時設(shè)置強陽性對照、弱陽性對照、陰性對照、陽性標準品對照，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用陽性梯度標準品的Ct值制作標準PCR熒光曲線，再依據(jù)樣品的Ct值計算DNA的含量[6]。

表1 血清乙肝病毒標志物(ELISA)和HBV-DNA熒光定量PCR檢測結(jié)果分析

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用百分率比較，采用 χ2檢驗[7]。

2 結(jié)果

360例乙型肝炎患者血清標本有9種乙肝病毒標志物模式，其中 HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)組患者最多為 101例，其次為 HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)70例，HBsAg(+)、HBcAb(+)43例；陽性率比較HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)的陽性率最高為97.03%，其次為HBsAg(+)HBcAb(+)陽性率為88.37%和HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)陽性率為78.57%，全陰性陽性率最低為16.67%，最高陽性率與最低陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.22，P=0.0154，P<0.05)，見表1。

3 討論

目前隨著乙型肝炎患者逐年增多及乙型肝炎病毒種類的不斷變化，因此對于乙肝病毒的復(fù)制情況及感染能力的全面掌握對于臨床治療意義重大[8]，乙肝病毒標志物檢測是診斷HBV感染的免疫學(xué)方法，能全面反映病毒侵入后機體的變化，HBVDNA測定則是病原學(xué)的檢查范疇，能準確反映感染者的狀態(tài)及病毒的感染類型和傳染性強弱，是病毒復(fù)制的指標[9]。檢測HBVDVA含量可直接反應(yīng)乙型肝炎患者體內(nèi)的病毒含量水平，一項肝炎患者血清中病毒標志物可直接反應(yīng)患者體內(nèi)的病毒含量。乙型病毒標志物呈多種模式，血清乙肝病毒標志物呈現(xiàn)不同表現(xiàn)形式，導(dǎo)致血清中HBV-DNA的檢出率也會呈現(xiàn)不同結(jié)果。實時動態(tài)熒光定量PCR檢測HBV-DNA是通過患者血液中病毒感染數(shù)量進行準確判斷的方法，是一種結(jié)合普通PCR高靈敏度、DNA雜交高特異性、光譜技術(shù)高精確定量的優(yōu)點對病毒DNA復(fù)制全面掌握的重要方式。該研究探討血清HBV-DNA熒光定量PCR檢測與乙肝病毒標志物模式的相關(guān)因素，結(jié)果表明乙肝大三陽即HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)檢出率高且病毒含量高，小三陽即且HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)陽性率較低。這與施志龍、陳繼梅在2011年研究結(jié)果一致[10]，表明HBeAg存在是乙肝病毒復(fù)制活躍的重要指標，患者血清中病毒拷貝數(shù)與HBeAg呈正相關(guān)。與相關(guān)文獻報道[11]一致，乙肝病毒標志物與HBV-DNA有明顯相關(guān)性，但是不同乙肝病毒標志物模式檢出率差異顯著。在大三陽患者檢測HBV-DNA為陰性，分析原可能是治療藥物導(dǎo)致HBV-DNA無法正常復(fù)制，導(dǎo)致擴增物對應(yīng)的乙肝病毒序列發(fā)生改變，患者體內(nèi)的病毒被整合到肝臟細胞中，導(dǎo)致血液中無法檢測病毒的存在，也可能是試劑的敏感性較差，在小三陽患者中陽性率明顯低于大三陽患者，并且部分小三陽患者HBV-DNA的含量均較低，少部分患者血清中含量較高，此時病毒未停止復(fù)制，只是患者的病毒基因出現(xiàn)變異，仍然具有較強的傳染能力。因此臨床上應(yīng)進行熒光定量PCR檢測結(jié)果與血清乙肝病毒標志物指標結(jié)合評價，全面掌握病毒感染復(fù)制情況并指導(dǎo)臨床科學(xué)治療，對于統(tǒng)計分析病毒的流行病學(xué)特點和提高預(yù)后療效有著重要價值。

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