耐寒柑橘愈傷組織誘導優(yōu)化

胡選萍+陳志遠

摘要：以耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）為試材，研究了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導的影響，優(yōu)化柑橘愈傷組織培養(yǎng)條件。結果表明，柑橘愈傷組織誘導中MT培養(yǎng)基的誘導效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，統(tǒng)計學分析差異顯著；帶外種皮消毒處理方式更有利于外植體的脫分化，愈傷誘導率均在90%以上；胚與子葉外植體分別在f與i培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳，其誘導率為93.10%與93.33%；培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0～3.0 mg/L適合柑橘愈傷組織的誘導，且激素KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用，當培養(yǎng)基中KT為0.5 mg/L時，誘導率增加25.75%，疏松愈傷率增加14.48%。

關鍵詞：耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）；愈傷組織；誘導；優(yōu)化

中圖分類號：S666 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4460-04

柑橘（Citrus reticulata Blanco）是世界四大水果之一，其國際貿易額位居世界第3，僅次于小麥和蔬菜[1，2]。柑橘隸屬蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus），其營養(yǎng)成分豐富，富含黃酮[3]，具有抗氧化、抗病毒、抗炎癥、抗癌活性、預防動脈硬化等作用[4，5]。陜西省漢中市城固縣作為陜南最大的柑橘生產基地，通過國家綠色食品發(fā)展中心認證的柑橘生產基地面積達到6 667 hm2，被國家林業(yè)部命名為“中國柑橘之鄉(xiāng)”[6]。柑橘作為陜南重要的經濟作物之一，在農業(yè)區(qū)域規(guī)劃中被放在重點優(yōu)先發(fā)展的地位。由于柑橘對低溫比較敏感，而漢中地區(qū)處亞熱帶北緣，冬季低溫和秋季多雨導致柑橘局部凍害一直是制約柑橘產業(yè)大發(fā)展的重要因素，因此提高柑橘的抗逆性對于柑橘產業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。近年來生物技術被廣泛應用于柑橘抗性資源的研究與開發(fā)利用中，并取得了顯著成果[7]。

本研究以耐寒柑橘為試材，研究了不同因子對柑橘愈傷組織誘導的效應方式與效應程度，為深入研究耐寒柑橘體細胞胚胎發(fā)生及抗寒機理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為陜西省漢中市城固縣柑橘生產基地的早熟耐寒品種日南1號，外植體來源于成熟柑橘果實種子，經晾曬、去雜后，剝離出未受精敗育種子胚與子葉作為研究試材。

試驗用NAA、6-BA、2，4-D與KT均為分析純；MS與MT培養(yǎng)基自配。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預處理 選擇飽滿圓潤、大小均一的柑橘種子浸泡8 h，用自來水沖洗掉表面的雜質，在流水下沖洗1～2 h，備用。在超凈工作臺將柑橘種子直接或剝離外種皮后用75%的乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡8～10 min，處理過程中不斷搖動，然后用無菌水沖洗5～6次，每次2～3 min。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中分離出胚與子葉，胚直接接種，子葉切分為長寬約為0.5 cm的小塊作為外植體。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 分別以MS與MT為基本培養(yǎng)基，按3.0%的量加入蔗糖，按0.6%的量加入瓊脂粉，添加以不同種類與濃度配比的生長調節(jié)因子，設計為16種組合配比（表1），調節(jié)pH為5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 愈傷組織的誘導 無菌操作條件下，將柑橘種子胚接入a～i培養(yǎng)基，子葉接入Ⅰ～Ⅶ及a～i培養(yǎng)基中。在溫度（25±2） ℃，相對濕度50%～60%的條件下，暗培養(yǎng)4周，觀察愈傷的發(fā)生時間、顏色、質地及生長情況，統(tǒng)計體積明顯膨大的外植體數與誘導出愈傷組織的外植體數，并依此計算出相應的二級變量。接種15 d后，去除污染與壞死材料，統(tǒng)計無菌外植體數（視為接種量），接種3周統(tǒng)計膨大的外植體數（視為膨大數），計算膨大率，膨大率=膨大數/接種量×100%。統(tǒng)計接種4周誘導出愈的外植體數（視為誘導數）與疏松愈傷組織的外植體數（視為疏松數），計算誘導率與疏松愈傷率，誘導率=誘導數/接種量×100%；疏松愈傷率=疏松數/誘導數×100%。

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對耐寒柑橘愈傷組織誘導的影響

從表2中可以看出，對于MS與MT兩種培養(yǎng)基體系而言，MT培養(yǎng)基的愈傷組織誘導效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基。MT培養(yǎng)基中愈傷組織發(fā)生時間提前1 d左右，且愈傷組織呈淡黃色，質地疏松，生長旺盛，品質好，后期褐變程度低。在MT培養(yǎng)基中（其中激素為2.0 mg/L 2，4-D），子葉外植體的膨大率（91.75%）與愈傷誘導率（87.61%）明顯高于MS培養(yǎng)基，且兩種不同處理間差異顯著（P<0.05）。同樣對于處理Ⅱ與處理Ⅵ（培養(yǎng)基中激素2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT）而言，處理Ⅵ的誘導率（94.31%）明顯高于處理Ⅱ（86.58%），表現出相似的MT誘導優(yōu)勢。因此，對于耐寒柑橘子葉外植體而言，MT為相對合適的基本培養(yǎng)基質。

2.2 消毒處理方式對耐寒柑橘愈傷組織誘導的影響

采用兩種不同外植體消毒處理方式：帶外種皮消毒處理，即柑橘種子不用預先剝去外種皮，直接用75%乙醇表面消毒30 s后，再用0.1% HgCl2浸泡10 min；不帶外種皮消毒處理，即先剝離外種皮，然后用75%乙醇與0.1% HgCl2配合消毒，乙醇處理同上，0.1% HgCl2處理8 min。試驗表明在兩種不同消毒處理方式下，柑橘子葉外植體脫分化與愈傷組織誘導形成存在明顯差異（圖1、圖2）。

帶外種皮消毒處理雖然子葉剝離略微困難，但外植體脫分化狀態(tài)較好，外植體多呈淡綠色，在培養(yǎng)初期均出現明顯膨大，5 d左右開始出現愈傷組織，且愈傷多呈現淡黃綠色，透明有光澤，且愈傷組織生長速度快，積累量較大。而不帶外種皮消毒處理消毒處理方式，外植體培養(yǎng)2～3 d后顏色變白，膨大程度較低，愈傷組織出現時間也相對較晚，大約7～10 d后有淡黃色的愈傷組織形成，到第4周愈傷組織的誘導形成基本穩(wěn)定，且愈傷積累量總體較少。從愈傷誘導效果來看，帶外種皮消毒明顯比不帶外種皮消毒脫分化效果好（圖1、圖2），不帶外種皮消毒處理柑橘子葉在Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基上的誘導率為80%左右，而帶外種皮消毒處理中外植體愈傷誘導率均在90%以上，甚至在處理Ⅱ可達到完全脫分化（誘導率100%），t檢驗表明，兩種消毒處理方式的膨大率與誘導率均差異顯著（P<0.05）。endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側面或遠培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導率93.33%），而此條件對胚（誘導率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導的恰當的激素種類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導的影響 2，4-D對愈傷組織誘導的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導率兩個效應變量上差異顯著。結果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產生愈傷組織的重要因子。當2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結構與質地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結與討論

愈傷組織的誘導發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質對植物離體培養(yǎng)中的細胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細胞分裂素類的對于誘導原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導的效應。結果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質量濃度水平差異和對外源激素的反應靈敏性不同有關[11]。在多數植物愈傷組織的誘導中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導率，而對愈傷組織的結構與品質沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導率，而且可以改變愈傷組織的結構與品質，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導方面的協(xié)同促進作用。

參考文獻：

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[12]申秋秀，胡根海，趙偉偉，等.不同濃度激素處理對棉花愈傷組織誘導的影響[J].種子，2009，28（7）：101-104.

[13]張彩俠，曹 彬，史 梅.不同激素對大葉黃楊幼莖愈傷組織的誘導試驗[J].貴州農業(yè)科學，2009，37（8）：25-27.endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側面或遠培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導率93.33%），而此條件對胚（誘導率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導的恰當的激素種類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導的影響 2，4-D對愈傷組織誘導的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導率兩個效應變量上差異顯著。結果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產生愈傷組織的重要因子。當2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結構與質地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結與討論

愈傷組織的誘導發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質對植物離體培養(yǎng)中的細胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細胞分裂素類的對于誘導原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導的效應。結果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質量濃度水平差異和對外源激素的反應靈敏性不同有關[11]。在多數植物愈傷組織的誘導中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導率，而對愈傷組織的結構與品質沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導率，而且可以改變愈傷組織的結構與品質，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導方面的協(xié)同促進作用。

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[13]張彩俠，曹 彬，史 梅.不同激素對大葉黃楊幼莖愈傷組織的誘導試驗[J].貴州農業(yè)科學，2009，37（8）：25-27.endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側面或遠培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導率93.33%），而此條件對胚（誘導率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導的恰當的激素種類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導的影響 2，4-D對愈傷組織誘導的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導率兩個效應變量上差異顯著。結果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產生愈傷組織的重要因子。當2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結構與質地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結與討論

愈傷組織的誘導發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質對植物離體培養(yǎng)中的細胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細胞分裂素類的對于誘導原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導的效應。結果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質量濃度水平差異和對外源激素的反應靈敏性不同有關[11]。在多數植物愈傷組織的誘導中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導率，而對愈傷組織的結構與品質沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導率，而且可以改變愈傷組織的結構與品質，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導方面的協(xié)同促進作用。

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