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      草莓鑲脈病毒粒子提取及電鏡觀察

      2014-11-20 18:52:08肖文斐裘劼人柳愛春等
      湖北農業(yè)科學 2014年18期

      肖文斐+裘劼人+柳愛春等

      摘要:從受感染的草莓(Fragaria sp)植株中提取了草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)粒子并對其進行了電鏡觀察。用CTAB法從草莓葉片中提取總核酸,設計SVBV外殼蛋白基因特異性引物,利用PCR方法對杭州地區(qū)的草莓鑲脈病毒感染情況進行檢測。檢測結果表明,在杭州地區(qū)大田種植的草莓中存在SVBV感染現(xiàn)象。從4株受感染草莓植株中分離克隆了SVBV的CP基因片段并測序;序列比較分析發(fā)現(xiàn)它們與已報道的美國SVBV分離物的CP基因(序列號NC_001725)核苷酸同源性為91%。利用差速離心法從上述草莓植株的葉片中提純SVBV病毒,在透射電鏡下觀察到SVBV病毒粒子呈球形,直徑約為40~55 nm。

      關鍵詞:草莓鑲脈病毒(SVBV);PCR檢測;病毒提取;電鏡觀察

      中圖分類號:S432.4+1;S431.192 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)18-4313-03

      草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,簡稱SVBV)在世界上分布廣泛,對草莓(Fragaria sp)危害較為嚴重,也是中國草莓生產的主要病毒病害之一,在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區(qū)均有發(fā)生[1,2]。SVBV在分類上屬花椰菜花葉病毒(Caulimoviruses,CaMV),是一種雙鏈DNA病毒,以半持久性方式通過蚜蟲或嫁接傳播。SVBV侵染可削弱草莓生長勢,降低產量及品質;而與其他病毒或細菌、真菌復合侵染則會造成嚴重病害發(fā)生,給草莓的生產帶來嚴重損失[3,4]。

      Petrzik等[5]1998年測定了SVBV美國加州分離物的全基因組序列,并在此基礎上發(fā)展了該病毒的PCR檢測。目前,國內外眾多研究者已利用PCR方法檢測了不同的SVBV分離物[6-12]。研究表明,由于SVBV來源、地域不同,基因組存在著分子變異,分子檢測方法也有所不同。其中,外殼蛋白在SVBV中的保守性較好,不同地區(qū)中SVBV不同分離物外殼蛋白基因間分子變異較小,通常作為PCR檢測的首選區(qū)域。

      雖然已對SVBV建立了高效、靈敏的PCR檢測方法。但在開展大規(guī)模病毒調查時,血清學檢測手段則更加簡單和實用。目前SVBV仍無商品化的抗血清檢測試劑,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測較難實施。本研究用超速離心法從感染草莓鑲脈病毒(SVBV)的草莓葉片中提純SVBV病毒,為進一步制備SVBV抗血清和單克隆抗體提供有效的抗原基礎。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      從浙江杭州地區(qū)采集帶疑似病癥和無癥狀草莓植株,盆栽種植于大棚,選取新鮮草莓葉片作為試驗材料。草莓品種為紅頰。

      1.2 方法

      1.2.1 病毒檢測

      1)草莓葉片總核酸提取 參照文獻[11]采用改進的CTAB法抽提草莓總核酸。將少量草莓葉片在液氮中迅速研碎,取約50 mg粉末加入盛有500 μL CTAB提取緩沖液(2% CTAB;100 mmol Tris, pH 8.0;20 mmol EDTA;1.4 mmol NaCl;使用前加入2%β-巰基乙醇)的1.5 mL Eppendorf 管中,65 ℃水浴20 min。用等體積氯仿/異戊醇(24︰1)抽提2次,上清液中加入1/10體積的3 mmol/L NaAc(pH 5.2)、2.5倍體積無水乙醇,反復顛倒數(shù)次,取沉淀。70%乙醇洗滌沉淀2次,放置在超凈工作臺上吹干,加入50 μL DEPC水溶解。用紫外分光光度計測定其OD260 nm。

      2)PCR反應體系 根據(jù)GenBank中的SVBV基因組序列,參照文獻[12]設計同源引物B1F(5′-GAATGGGACAATGAAATGAG-3′)和B1R(5′- GTGAGGAGAACTTAGGACA-3′)。所用引物由上海英駿生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系總體積為20.0 μL,其中包括模板DNA 1.0 μL、引物(10 μmol/L)0.5 μL, Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL,dNTP(10 mmol/L) 0.4 μL,10×PCR Buffer(含 25 mmol/L MgCl2) 2.0 μL,ddH2O 13.4 μL。所用試劑購于寶生物(大連)生物工程有限公司。擴增程序為: 94 ℃ 預變性3 min;94 ℃變性1 min,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。

      3)目的片段的克隆及測序 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司產品]從凝膠中回收目的片段,與pUC19-T Easy載體連接,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經藍白斑篩選,挑取白色菌落培養(yǎng),提取質粒,通過PCR鑒定陽性克隆。測序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。獲得的序列用BLAST在GenBank中進行檢索分析,利用軟件CLUSTAL 1.83進行多序列比對。

      1.2.2 病毒純化 參照文獻[13]中花椰菜花葉病毒的提取方法進行操作。收集100~200 g新鮮草莓葉片,置于200 mL 0.5 μmol/L 的磷酸鈉(pH 7.2)溶液中磨成勻漿,每100 g勻漿加入0.75 g亞硫酸鈉,冰上操作;將勻漿倒入燒杯中,每100 mL勻漿加入6 g尿素和25 mL Triton X-100, 4 ℃攪拌過夜;4 ℃ 4 000 g離心10 min;輕柔地用4層紗布過濾,將液體倒入離心管,4 ℃ 7 000 g離心2 h;倒棄上清液,每管用 1mL滅菌去離子水重懸沉淀1~2 h;收集重懸液,用微型離心機離心2次,去除不溶顆粒;將上清液用去離子水稀釋到一定體積,13 600 g 4 ℃離心1 h;用0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)重懸病毒粒子,4 ℃或-20 ℃保存。紫外分光光度計測定其OD260 nm。

      1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液(5 uL)置于2%磷鎢酸溶液(pH 6.8)中負染約30 min,用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

      2 結果與分析

      2.1 草莓總核酸情況

      采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色,易溶于水,不黏稠,多糖含量較少。經紫外分光光度計測定,核酸濃度為120~400 ng/uL,OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其DNA條帶清晰,完整性較好(圖1)。

      2.2 PCR產物電泳分析

      以提取的草莓總核酸為模板,用引物(B1F、B1R)進行PCR反應,擴增獲得了與預期片段(574 bp)大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區(qū)采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份,共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中,多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%,而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%;田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高,最高的為82.5%,未明顯發(fā)病區(qū)域的病毒侵染率在10%~28%之間。

      2.3 基因片段序列測定

      選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序,測序結果表明,4個克隆片段的序列完全一致,序列總長574 bp,在NCBI網(wǎng)站(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast分析,發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物(序列號AY862389)核苷酸同源性最高,為95%;與沈陽分離物(序列號AY955374)同源性為94%,而與美國分離物(序列號NC_001725)同源性為91%。而該區(qū)段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105,同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

      2.4 病毒純化情況

      病毒具有特有的紫外吸收峰,通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜,發(fā)現(xiàn)其OD260 nm為1.454,OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13],花椰菜花葉病毒消光系數(shù)E(0.1%、1 cm、260 nm)為7,根據(jù)公式,病毒濃度(mg/mL)=OD260 nm×稀釋倍數(shù)/E,推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

      2.5 病毒粒子的形態(tài)

      病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后,在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子,直徑約為40~55 nm,粒子中心可見清晰核心(圖2)。該病毒粒子形態(tài)與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

      3 小結與討論

      SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一,在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區(qū)均有發(fā)生,但經檢索,未發(fā)現(xiàn)在浙江草莓種植區(qū)發(fā)生該病的報道。本研究發(fā)現(xiàn),杭州地區(qū)栽培草莓中也存在SVBV感染。其中,多代苗的侵染率高于低代苗,而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數(shù)量多也會增加SVBV感染率。因此,田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗,同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

      前人研究表明[6,11,15],SVBV存在株系分化現(xiàn)象,不同基因型在不同生態(tài)地理條件下核酸序列存在變化,即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析,發(fā)現(xiàn)SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高,與沈陽分離物次之,與美國分離物同源性最低。由此推測,不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此,在病毒PCR檢測的實踐中,特異引物的選擇設計尤其重要,同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

      SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中,參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13],在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前,還未有商業(yè)化的SVBV抗體研制成功,限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16,17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高,通過商業(yè)途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清,為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

      參考文獻:

      [1] 王國平,劉福昌,國際翔.我國草莓主栽區(qū)病毒種類的鑒定[J].植物病理學報,1991,21(1):9-14.

      [2] HONETSLEGROVA J,MRAZ I,SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie,1995,385:29-32.

      [3] MORRIS T J,MULLIN R H,SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology,1980,70:156-160.

      [4] MASS J L.草莓病蟲害概論[M].第二版.張運濤,張國珍,譯.北京:中國農業(yè)出版社,2012.

      [5] PETRZIK K,BENES V,MRAZ I,et al.Strawberry vein banding vires-definitive member of the genus Caulimovirus[J].Vires Genes,1998,16(3):303-305.

      [6] MRAZ I,PETRZIK K,SIP M,et al.Variability in coat protein homology among American and European sources of strawberry vein binding virus[J]. Plant Disease,1998,82:544-546.

      [7] 肖 敏,張志宏.草莓鑲脈病毒研究進展[J].遼寧農業(yè)科學,2005(4):36-38.

      [8] ROBERT R M,IOANNIS E T.Characterization and recent advances in detection of strawberry viruses[J]. Plant Disease,2006, 90(4):384-396.

      [9] 陳曉軍,王敬東,馬洪愛,等.草莓鑲脈病毒檢測方法研究[J].北方園藝,2010 (22):123-125.

      [10] 隋 春,吳祿平,張志宏.利用PCR技術檢測草莓鑲脈病毒[J].園藝學報,2003,30(1):82-84.

      [11] 肖 敏,張志宏,代紅艷,等.PCR檢測草莓鑲脈病毒的穩(wěn)定性研究[J].果樹學報,2005,22(5):483-487.

      [12] 周厚成,李思源,何水濤,等.草莓鑲脈病毒的PCR檢測及特異片段的序列分析[J].果樹學報,2005,22(3):286-288.

      [13] HULL R,SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus: An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology,1976,31:93-100.

      [14] 章紹延,王健華,譚老喜,等.一辣椒環(huán)斑病毒提純及抗血清制備[J].熱帶作物學報,2013,34(3):534-537.

      [15] 洪 健,李德葆,周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京:科學出版社,2001.

      [16] 江 彤,楊友志,丁 菲,等.草莓鑲脈病毒外殼蛋白的原核表達及多抗血清制備[J].南京農業(yè)大學學報,2012,35(6):30-34.

      [17] 江 彤,謝朝陽,丁 菲,等.草莓鑲脈病毒ORF Ⅵ基因的原核表達與抗血清制備[J].植物保護學報,2013,40(6):511-516.

      1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液(5 uL)置于2%磷鎢酸溶液(pH 6.8)中負染約30 min,用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

      2 結果與分析

      2.1 草莓總核酸情況

      采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色,易溶于水,不黏稠,多糖含量較少。經紫外分光光度計測定,核酸濃度為120~400 ng/uL,OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其DNA條帶清晰,完整性較好(圖1)。

      2.2 PCR產物電泳分析

      以提取的草莓總核酸為模板,用引物(B1F、B1R)進行PCR反應,擴增獲得了與預期片段(574 bp)大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區(qū)采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份,共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中,多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%,而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%;田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高,最高的為82.5%,未明顯發(fā)病區(qū)域的病毒侵染率在10%~28%之間。

      2.3 基因片段序列測定

      選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序,測序結果表明,4個克隆片段的序列完全一致,序列總長574 bp,在NCBI網(wǎng)站(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast分析,發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物(序列號AY862389)核苷酸同源性最高,為95%;與沈陽分離物(序列號AY955374)同源性為94%,而與美國分離物(序列號NC_001725)同源性為91%。而該區(qū)段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105,同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

      2.4 病毒純化情況

      病毒具有特有的紫外吸收峰,通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜,發(fā)現(xiàn)其OD260 nm為1.454,OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13],花椰菜花葉病毒消光系數(shù)E(0.1%、1 cm、260 nm)為7,根據(jù)公式,病毒濃度(mg/mL)=OD260 nm×稀釋倍數(shù)/E,推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

      2.5 病毒粒子的形態(tài)

      病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后,在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子,直徑約為40~55 nm,粒子中心可見清晰核心(圖2)。該病毒粒子形態(tài)與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

      3 小結與討論

      SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一,在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區(qū)均有發(fā)生,但經檢索,未發(fā)現(xiàn)在浙江草莓種植區(qū)發(fā)生該病的報道。本研究發(fā)現(xiàn),杭州地區(qū)栽培草莓中也存在SVBV感染。其中,多代苗的侵染率高于低代苗,而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數(shù)量多也會增加SVBV感染率。因此,田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗,同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

      前人研究表明[6,11,15],SVBV存在株系分化現(xiàn)象,不同基因型在不同生態(tài)地理條件下核酸序列存在變化,即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析,發(fā)現(xiàn)SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高,與沈陽分離物次之,與美國分離物同源性最低。由此推測,不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此,在病毒PCR檢測的實踐中,特異引物的選擇設計尤其重要,同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

      SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中,參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13],在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前,還未有商業(yè)化的SVBV抗體研制成功,限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16,17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高,通過商業(yè)途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清,為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

      參考文獻:

      [1] 王國平,劉福昌,國際翔.我國草莓主栽區(qū)病毒種類的鑒定[J].植物病理學報,1991,21(1):9-14.

      [2] HONETSLEGROVA J,MRAZ I,SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie,1995,385:29-32.

      [3] MORRIS T J,MULLIN R H,SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology,1980,70:156-160.

      [4] MASS J L.草莓病蟲害概論[M].第二版.張運濤,張國珍,譯.北京:中國農業(yè)出版社,2012.

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      [6] MRAZ I,PETRZIK K,SIP M,et al.Variability in coat protein homology among American and European sources of strawberry vein binding virus[J]. Plant Disease,1998,82:544-546.

      [7] 肖 敏,張志宏.草莓鑲脈病毒研究進展[J].遼寧農業(yè)科學,2005(4):36-38.

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      [9] 陳曉軍,王敬東,馬洪愛,等.草莓鑲脈病毒檢測方法研究[J].北方園藝,2010 (22):123-125.

      [10] 隋 春,吳祿平,張志宏.利用PCR技術檢測草莓鑲脈病毒[J].園藝學報,2003,30(1):82-84.

      [11] 肖 敏,張志宏,代紅艷,等.PCR檢測草莓鑲脈病毒的穩(wěn)定性研究[J].果樹學報,2005,22(5):483-487.

      [12] 周厚成,李思源,何水濤,等.草莓鑲脈病毒的PCR檢測及特異片段的序列分析[J].果樹學報,2005,22(3):286-288.

      [13] HULL R,SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus: An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology,1976,31:93-100.

      [14] 章紹延,王健華,譚老喜,等.一辣椒環(huán)斑病毒提純及抗血清制備[J].熱帶作物學報,2013,34(3):534-537.

      [15] 洪 健,李德葆,周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京:科學出版社,2001.

      [16] 江 彤,楊友志,丁 菲,等.草莓鑲脈病毒外殼蛋白的原核表達及多抗血清制備[J].南京農業(yè)大學學報,2012,35(6):30-34.

      [17] 江 彤,謝朝陽,丁 菲,等.草莓鑲脈病毒ORF Ⅵ基因的原核表達與抗血清制備[J].植物保護學報,2013,40(6):511-516.

      1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液(5 uL)置于2%磷鎢酸溶液(pH 6.8)中負染約30 min,用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

      2 結果與分析

      2.1 草莓總核酸情況

      采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色,易溶于水,不黏稠,多糖含量較少。經紫外分光光度計測定,核酸濃度為120~400 ng/uL,OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其DNA條帶清晰,完整性較好(圖1)。

      2.2 PCR產物電泳分析

      以提取的草莓總核酸為模板,用引物(B1F、B1R)進行PCR反應,擴增獲得了與預期片段(574 bp)大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區(qū)采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份,共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中,多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%,而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%;田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高,最高的為82.5%,未明顯發(fā)病區(qū)域的病毒侵染率在10%~28%之間。

      2.3 基因片段序列測定

      選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序,測序結果表明,4個克隆片段的序列完全一致,序列總長574 bp,在NCBI網(wǎng)站(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast分析,發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物(序列號AY862389)核苷酸同源性最高,為95%;與沈陽分離物(序列號AY955374)同源性為94%,而與美國分離物(序列號NC_001725)同源性為91%。而該區(qū)段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105,同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

      2.4 病毒純化情況

      病毒具有特有的紫外吸收峰,通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜,發(fā)現(xiàn)其OD260 nm為1.454,OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13],花椰菜花葉病毒消光系數(shù)E(0.1%、1 cm、260 nm)為7,根據(jù)公式,病毒濃度(mg/mL)=OD260 nm×稀釋倍數(shù)/E,推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

      2.5 病毒粒子的形態(tài)

      病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后,在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子,直徑約為40~55 nm,粒子中心可見清晰核心(圖2)。該病毒粒子形態(tài)與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

      3 小結與討論

      SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一,在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區(qū)均有發(fā)生,但經檢索,未發(fā)現(xiàn)在浙江草莓種植區(qū)發(fā)生該病的報道。本研究發(fā)現(xiàn),杭州地區(qū)栽培草莓中也存在SVBV感染。其中,多代苗的侵染率高于低代苗,而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數(shù)量多也會增加SVBV感染率。因此,田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗,同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

      前人研究表明[6,11,15],SVBV存在株系分化現(xiàn)象,不同基因型在不同生態(tài)地理條件下核酸序列存在變化,即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析,發(fā)現(xiàn)SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高,與沈陽分離物次之,與美國分離物同源性最低。由此推測,不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此,在病毒PCR檢測的實踐中,特異引物的選擇設計尤其重要,同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

      SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中,參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13],在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前,還未有商業(yè)化的SVBV抗體研制成功,限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16,17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高,通過商業(yè)途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清,為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

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