豬支原體肺炎常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法概述

于新友，李天芝，王金良，李書光，苗立中，沈志強(qiáng),

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

本文對豬支原體肺炎的臨床癥狀、病理學(xué)變化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及PCR診斷方法的最新研究進(jìn)展及各種診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行全面概述，以期為實(shí)驗(yàn)室尤其是基層獸醫(yī)工作者對豬支原體肺炎的早期診斷和及時防治提供一定的指導(dǎo)，為預(yù)防和控制豬支原體肺炎奠定基礎(chǔ)。

豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性呼吸道傳染病，臨床上以咳嗽、氣喘和肺部典型的“蝦肉”樣變?yōu)樘卣鳎哂薪佑|傳染性高、死亡率低和誘發(fā)性強(qiáng)的特點(diǎn)。Mhp是重要的豬支原體病原之一，可導(dǎo)致豬地方性肺炎。不同年齡、性別、品種的豬群均可感染，以咳嗽和氣喘為主要癥狀。雖然本病死亡率不高，但嚴(yán)重影響豬群的生長，導(dǎo)致料肉比增大、飼料報(bào)酬率降低。據(jù)不同國家的屠宰檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明，豬支原體肺炎的典型病變率達(dá)30%～80%。因此，對豬支原體肺炎正確診斷非常重要。

1 臨床癥狀

豬支原體肺炎有明顯的喘氣癥狀，咳嗽，腹式呼吸，體溫及食欲變化不大而生長發(fā)育遲緩，多在天氣變化、飼養(yǎng)管理方式改變等應(yīng)激因素的作用下誘發(fā)本病。根據(jù)病的經(jīng)過，大致可分為急性、慢性和隱性三種類型，而以慢性和隱性最多，但所有這些類型可隨條件的變動而互相轉(zhuǎn)變，不能截然區(qū)分。急性型：常見于新發(fā)本病的豬群，尤以懷孕母豬、仔豬多見。病豬體溫正常（伴有繼發(fā)感染時可升至40℃以上），精神不振，呈腹式呼吸。慢性型：常見于老疫區(qū)的架子豬、育肥豬和后備母豬。早、晚吃食后或運(yùn)動時發(fā)生咳嗽，咳嗽時，站立不動，背拱起，頸伸直，頭下垂，直至咳出分泌物為止。隨著病程的發(fā)展，常出現(xiàn)不同程度的呼吸困難。體溫一般正常，發(fā)育遲緩。隱性型：偶見咳嗽和氣喘，生長發(fā)育幾乎正常。一般情況下死亡率不高，但繼發(fā)性感染也造成嚴(yán)重死亡。診斷本病應(yīng)以一個豬場整個豬群為單位，當(dāng)豬群中發(fā)現(xiàn)一頭病豬，就可以認(rèn)為是病豬群。

2 病理變化

剖檢發(fā)病嚴(yán)重及病死豬可見病變主要在肺臟、肺門淋巴結(jié)和縱隔淋巴結(jié)。當(dāng)病處在炎癥發(fā)展期，肺臟膨大，有不同程度的氣腫和水腫。雙肺的心葉、尖葉、中間葉和部分病例的膈葉前下緣出現(xiàn)對稱性、融合性支氣管肺炎病變，其中以心葉最明顯，尖葉和中間葉次之。病變部位呈淡灰紅色或灰紅色、半透明狀、界限明顯、指壓無彈性、似鮮嫩的肌肉狀，俗稱“肉變”。隨著病程的延長和病情的加重，病變部位的顏色也逐漸加深，呈淡紫色、深紫色或灰白色、灰黃色，堅(jiān)韌度增加，外觀像胰臟樣，俗稱“胰變”或“蝦肉樣變”。切面濕潤致密，支氣管流出渾濁、灰白色帶泡沫的漿液性或黏液性液體。肺小葉間結(jié)締組織增生、硬化。肺門淋巴結(jié)和縱隔淋巴結(jié)顯著腫大數(shù)十倍，呈灰白色，水腫，切面邊緣外翻，有時出現(xiàn)輕度充血。肝臟、脾臟、腸管表面覆蓋纖維素性滲出物；肝臟腫大、變硬，膽囊萎縮無膽汁；腎臟表面凹陷、有出血點(diǎn)；關(guān)節(jié)腔充滿黃綠色纖維素性、化膿性液體；肺淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)腫大，切面有滲出物；腦膜水腫、出血。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)既可以檢測抗原，也可以檢測抗體，具有快速、簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量樣品的檢測。ELISA是目前國內(nèi)外最常用于診斷Mhp的方法之一，具有能進(jìn)行定量分析、敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。劉茂軍等選用MhpJ株培養(yǎng)物制備抗原，建立檢測Mhp抗體的間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)方法。對136份樣品檢測結(jié)果表明，建立的Mhp間接ELISA抗體檢測方法與美國IDEXX公司生產(chǎn)的Mhp抗體檢測試劑盒檢測的符合率達(dá)到83.8%，假陰性率8.8%，假陽性1.5%。逯曉敏等建立了穩(wěn)定而特異的抗MhpIgA的間接ELISA檢測方法。批間與批內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果證明該方法具有很好的穩(wěn)定性。初步應(yīng)用表明，該方法可用于Mhp感染或免疫狀態(tài)的臨床監(jiān)測。祝永琴等將已構(gòu)建的含有MhpP36基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZA-A-P36在酵母菌X-33里進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行Western-blotting鑒定。建立了穩(wěn)定的抗Mhp IgG的間接ELISA檢測方法。應(yīng)用該方法檢測豬鼻支原體、豬絮狀支原體、豬圓環(huán)病毒陽性血清等都是陰性，說明該方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于8%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。張長瑩等以原核表達(dá)純化的豬支原體MSG1重組蛋白為包被抗原，建立了檢測豬支原體的間接ELISA診斷方法。該檢測方法敏感性高、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好。該研究表明建立的間接ELISA方法為豬支原體的檢測和區(qū)域流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡便的血清學(xué)診斷方法。劉茂軍等利用MhpNJ株的DnaK基因通過SOE-PCR擴(kuò)增和突變，獲得了目的片段并插入表達(dá)載體pET-28a(+)中，然后轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)。重組質(zhì)粒經(jīng)1毫摩爾/升IPTG在37℃溫度下誘導(dǎo)5小時，目的蛋白可達(dá)到總蛋白的14.1%。WesternBlotting證明表達(dá)的重組蛋白具有Mhp反應(yīng)原性，用該重組蛋白建立的ELISA方法可檢測到Mhp抗體。

4 PCR方法

PCR技術(shù)具有靈敏、特異、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，也是目前豬支原體肺炎準(zhǔn)確、簡單、快速診斷的主要方法。

4.1 常規(guī)PCR

利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以快速地對培養(yǎng)物、肺臟、鼻拭子、支氣管洗液進(jìn)行檢查，取得了令人滿意的結(jié)果。于敏等根據(jù)國內(nèi)外發(fā)表Mhp 16srRNA基因設(shè)計(jì)了一對特異性引物，擴(kuò)增出一個大小為653bp的特異性片段，敏感性試驗(yàn)顯示這對引物能夠檢測到1ng的DNA，結(jié)果表明此方法特異且敏感。劉茂軍等根據(jù)Mhp的P36基因序列設(shè)計(jì)一對引物，建立了Mhp特異且敏感的PCR檢測方法，可區(qū)別豬鼻支原體、絮狀支原體和雞毒支原體，最低檢出量為4.26ng。張紅云等根據(jù)GenBank中MhpJ株P(guān)36蛋白基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)1對引物，建立了快速檢測Mhp的PCR方法。采用所建立的PCR方法對42份疑似豬支原體肺炎（MPS）病料進(jìn)行臨床診斷，發(fā)現(xiàn)有13份呈陽性（31.0%）。該P(yáng)CR方法適合于MPS的臨床診斷，可為其防控提供可靠依據(jù)。王貴平用PCR方法對從湖南省長沙市收集的326份病料分別進(jìn)行了Mhp和豬鼻支原體檢測，并對部分基因進(jìn)行了序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mhp檢出率為24.4%。朱鳳瓊等通過設(shè)計(jì)1對針對16srRNA的引物，建立了該病原的PCR檢測方法，該方法能從標(biāo)準(zhǔn)株和分離株中獲得陽性擴(kuò)增，但不會與其他種類支原體或者是豬呼吸道中的常見微生物發(fā)生交叉反應(yīng)。為證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對2個PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測序和序列分析，證實(shí)為肺炎支原體。

4.2 套式PCR

套式PCR又稱巢式PCR，即在第一對引物（外套引物）的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)另行設(shè)計(jì)一對引物（內(nèi)套引物），用外套的擴(kuò)增產(chǎn)物做模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增。套式PCR外套擴(kuò)增增加了起始模板量，內(nèi)套引物擴(kuò)增將目的基因進(jìn)一步倍增至可觀察的量，由于采用兩對不同的引物二級放大，故可提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性，使靈敏度和特異性高于傳統(tǒng)的PCR方法。逯曉敏等根據(jù)GenBank中登錄的MhpP36(L-乳酸脫氫酶)全基因序列，設(shè)計(jì)合成了2對引物，建立套式PCR方法。運(yùn)用該方法對Mhp不同菌株培養(yǎng)物進(jìn)行了擴(kuò)增，并對經(jīng)肺內(nèi)免疫豬支原體肺炎活疫苗后支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，不同菌種均能擴(kuò)增出427bp的目的條帶，而其他病原菌未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。建立的套式PCR方法檢測Mhp的最低檢測限度為10個CCU(顏色變化單位)。吉瑪?shù)冉⒘藱z測Mhp的巢式PCR方法。結(jié)果表明，該方法對雞毒支原體、豬鼻支原體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；第1次擴(kuò)增的敏感性是10皮克，第2次擴(kuò)增的敏感性是0.1皮克。

4.3 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR是將PCR技術(shù)和光譜技術(shù)有效結(jié)合的一種核酸定量技術(shù)，克服了普通PCR反應(yīng)時間較長、擴(kuò)增產(chǎn)物需用瓊脂糖凝膠電泳檢測、易出現(xiàn)假陽性等缺點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。宋建領(lǐng)等根據(jù)GenBank登錄的Mhp黏附素P97基因序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物和1條探針，優(yōu)化了Mhp實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，該方法能特異地檢測Mhp，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒，豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒等病原檢測無交叉反應(yīng)；針對Mhp陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測，靈敏度可以達(dá)到10拷貝；重復(fù)性檢測Ct值變異系數(shù)在0.78%～1.16%之間。用建立的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，對40份臨床樣品檢測，結(jié)果表明肺臟拭子與肺臟懸液陽性率完全一致，而鼻腔拭子檢出率較低。同戈等建立了以P110基因序列作為靶序列的MhpSYBRGreen熒光定量PCR檢測方法，該方法具有良好的特異性、重復(fù)性，能夠檢測到10復(fù)制/微升的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，可用于Mhp培養(yǎng)疫苗半成品的快速定量檢測。丁敏等根據(jù)Mhp保守區(qū)域P110基因序列，設(shè)計(jì)一對特異引物和TaqMan探針，同時構(gòu)建了P110基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并對TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了可以對Mhp培養(yǎng)物定量的熒光定量PCR檢測方法。研究結(jié)果表明，該方法檢測靈敏度可達(dá)13復(fù)制/微升。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。郭盼盼等建立了MhpLAMP的快速檢測方法，該方法以Mhp保守性基因16SrRNA為靶序列設(shè)計(jì)了6條特異引物，在63℃等溫條件下，30分鐘即可完成反應(yīng)。結(jié)果顯示，LAMP技術(shù)優(yōu)于PCR技術(shù)。在敏感性試驗(yàn)中，LAMP方法的能檢測出10個包含靶基因片段的重組質(zhì)粒，敏感性高于PCR方法10倍；特異性試驗(yàn)中，LAMP方法和PCR方法均顯示出了高度的特異性；在對127個臨床鼻拭子樣本的檢測中，LAMP方法檢測結(jié)果是所有樣本都為陽性，而PCR檢測出了116份陽性。證明所建立的方法，對臨床樣本的檢測的敏感度高于常規(guī)的PCR法。李鵬等根據(jù)GenBank中登錄的Mhp的核苷酸序列，設(shè)計(jì)4條特異性引物，用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對內(nèi)外引物濃度、dNTP＋和MgSO4濃度及BstDNA聚合酶用量等進(jìn)行優(yōu)化，建立MhpLAMP檢測方法，應(yīng)用該方法檢測多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌均呈陰性；當(dāng)Mhp的拷貝數(shù)高于3時，均可檢測到該病原體。LAMP方法快速、靈敏、特異、無需特殊的儀器，為基層實(shí)驗(yàn)室Mhp的檢測提供了簡單快速的方法，特別適合基層實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)殖場在臨床中應(yīng)用。

6 結(jié)語

病原的快速而準(zhǔn)確的診斷是解決當(dāng)今威脅畜牧業(yè)的各類傳染病的決定性因素。用于豬支原體肺炎的診斷方法很多，實(shí)時熒光定量敏感性比常規(guī)PCR和套氏PCR高，但同時對操作人員、儀器設(shè)備與試劑要求太高，一般實(shí)驗(yàn)室很難具備試驗(yàn)條件。ELISA方法具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測快速、重復(fù)性好、無輻射、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，適合基層進(jìn)行大批量檢測。LAMP特異性強(qiáng)、靈敏性高、成本低、不需要PCR儀，僅需要一個恒溫水浴鍋即可完成核酸的擴(kuò)增，特別適合基層部門應(yīng)用。無論哪一種方法都不能徹底解決所有的問題，可以根據(jù)試驗(yàn)的目的和要求，選擇最適宜的檢測方法或?qū)追N檢測方法組合起來應(yīng)用，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療、力爭從根本上解決該病的防控問題。隨著分子生物學(xué)進(jìn)一步發(fā)展，相信一些特異性強(qiáng)、靈敏性高、簡便易行的新型診斷方法終將問世并得以推廣應(yīng)用。