溫度、鹽度對(duì)刺參胚胎發(fā)育的影響

孫吉東

目前刺參育苗與養(yǎng)殖生產(chǎn)面臨著諸多問(wèn)題[1-2]，為了刺參增養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]，一定要深刻認(rèn)識(shí)刺參的生物學(xué)特性，特別是對(duì)溫度、鹽度[4]等水質(zhì)條件的要求，掌握溫度和鹽度對(duì)刺參在胚胎發(fā)育、人工育苗及增養(yǎng)殖的影響至關(guān)重要[5]。通過(guò)計(jì)算孵化率而掌握刺參胚胎發(fā)育所需最適溫度和鹽度，最大限度地提高刺參的育苗產(chǎn)量，為此我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)器材與相關(guān)材料的準(zhǔn)備

1.1.1玻璃器材250 mL燒杯35個(gè)，500 mL燒杯2個(gè)；1 000 mL燒杯2個(gè)；500 mL量筒2個(gè)、100 mL量筒1個(gè)；1 mL、 5 mL、10 mL膠頭吸管各2個(gè)、3 mL吸管若干；玻璃棒2個(gè)；玻璃棒溫度計(jì)6個(gè)；漏斗3個(gè)；5 000 mL三角燒瓶8個(gè)；載玻片、蓋玻片各1盒。

1.1.2塑料器材塑料器材：50 L塑料孵化箱8個(gè)； 20 L水桶16個(gè)；水舀2個(gè)。

1.1.3其他器材其他器材：顯微鏡；2 000 W加熱棒6個(gè)；可調(diào)自動(dòng)控溫儀8個(gè)；數(shù)碼照相機(jī)1個(gè)；海水密度計(jì)1個(gè)；0～100‰鹽度計(jì)1個(gè)。

3結(jié)果與討論

從表1和表3得出：溫度在20～21 ℃時(shí)，鹽度10‰和50‰的情況下，胚胎完全不能正常發(fā)育，鹽度20‰和40‰時(shí)胚胎除了出現(xiàn)極體外，其它過(guò)程都不能正常進(jìn)行，而鹽度在29‰時(shí)胚胎發(fā)育能正常進(jìn)行。而且變態(tài)形成小耳狀幼體的時(shí)間是25 h 20 min～31 h 30 min。

從表2和表3得出：鹽度在29‰的情況下，溫度在12 ℃和35 ℃及40 ℃的情況下，胚胎都不能正常發(fā)育，溫度在28 ℃的情況下，除了可見(jiàn)胚胎極體出現(xiàn)和分裂成2個(gè)細(xì)胞，其它都不能正常進(jìn)行。溫度在20 ℃的情況下，形成小耳狀幼體的時(shí)間是25 h 20 min～31 h 30 min。

從表3可以看出：在溫度20～21 ℃時(shí)，鹽度29‰的情況下，刺參胚胎發(fā)育能正常進(jìn)行，發(fā)育過(guò)程經(jīng)過(guò)了卵裂、囊胚、原腸胚、形成耳狀幼蟲[10]。

從表4可以看出：溫度在20～21 ℃的情況下，鹽度在22‰、27‰、32‰時(shí)孵化率分別為55%、75%、50%。

從表5可以得出：鹽度在27‰的情況下，溫度15 ℃、20 ℃、28 ℃、30 ℃時(shí)，孵化率分別為35%、75%、60%、55%。

當(dāng)水溫在20～21 ℃時(shí)，鹽度的變化使孵化率由大變小的順序?yàn)椋?7‰>22‰>32‰>20‰=36‰ ；

當(dāng)鹽度在27‰時(shí)，溫度的變化對(duì)孵化率由大到小的影響：20 ℃>28 ℃>30 ℃>15 ℃。

4結(jié)論

溫度在20～21 ℃的情況下，而鹽度在22‰～29‰時(shí)刺參胚胎發(fā)育能正常進(jìn)行，而且孵化率在50%以上。

鹽度在27‰的情況下，而溫度在20～30 ℃時(shí)刺參胚胎發(fā)育都能正常進(jìn)行，孵化率在55%以上。

刺參胚胎正常發(fā)育的條件是溫度20～30 ℃，鹽度22‰～29‰，而且孵化率最高的條件為20 ℃，鹽度27‰，孵化率為75%。

參考文獻(xiàn)：

[1]

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[2] 隋錫林，鄧歡.刺參池塘養(yǎng)殖的病害及防治對(duì)策[J].水產(chǎn)科學(xué)，2004，23（6）：22-23

[3] 王連華.無(wú)公害刺參養(yǎng)殖技術(shù)[J].齊魯漁業(yè)，2004，22（12）：22-24

[4] 陳勇，高峰，劉國(guó)山，等.溫度、鹽度和光照周期對(duì)刺參生長(zhǎng)及行為的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007，31（5），687-691

[5] 陳愛(ài)華.刺參養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控技術(shù)[J].中國(guó)水產(chǎn)，2008（11）：57-58

[6] 隋錫林.刺參人工育苗及增養(yǎng)殖技術(shù)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2003，22（06）：52-53

[7] 王印庚，榮小軍，張春云，等.養(yǎng)殖海參主要疾病及防治技術(shù)[J].海洋科學(xué)，2005（03）：1-7

[8] 張群樂(lè)，劉永宏.海參海膽增養(yǎng)殖技術(shù)[M].青島：青島海洋大學(xué)出版社，1998：28-29

[9] 譚杰，孫慧玲，高菲，等.刺參受精及早期胚胎發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（2）：272-275

[10] 山東海洋學(xué)院海洋生物系.刺參的生殖和發(fā)育[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，1977（Z4）：10-16

（收稿日期：2014-08-02；修回日期：2014-08-18）

1.1.4相關(guān)材料相關(guān)材料：脫脂棉2卷；10 mm2銅電線50 m；多孔插排2個(gè)；甲醛1瓶；冷凍礦泉水1箱；鹵水10 L。

1.2實(shí)驗(yàn)前親參的準(zhǔn)備

1.2.1采捕時(shí)間采捕時(shí)間：在2013年10月底、11月初采捕一批親參。

1.2.2采捕地點(diǎn)采捕地點(diǎn)：金州玉兔島自然海區(qū)。

1.2.3采捕數(shù)量采捕數(shù)量：共采捕360頭親參，每個(gè)平均250 g以上[6]。

1.2.4工具消毒工具消毒：采捕工具使用前浸泡消毒處理，用清水清洗干凈后使用。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1刺參的培育管理

水溫：親參入池水溫為10 ℃，適應(yīng)3 d后開(kāi)始升溫，每3 d升0.5 ℃，升到14 ℃后開(kāi)始恒溫培養(yǎng)，升至16 ℃恒溫培養(yǎng)，直到自然排卵。

餌料：采用干海泥和配合飼料混合投喂，二者混合后用水?dāng)嚢?，做成條形或塊狀曬干后投喂。

換水與倒池：3 d換水清底一次，15 d倒池一次。

充氣：采取間歇式[7]，充1 h停0.5 h，暗光培育。

鹽度：29‰

1.3.2實(shí)驗(yàn)用水調(diào)配淡水鹽度為0‰，鹵水的鹽度為290‰。自然海水的鹽度是29‰；實(shí)驗(yàn)的鹽度設(shè)有10‰、20‰、30‰、40‰、50‰以及22‰、27‰、32‰、36‰；低鹽度的海水用自然水（29‰）加淡水調(diào)配，高鹽度的用自然水（29‰）加鹵水調(diào)配。

1.3.3計(jì)算公式

當(dāng)降低鹽度時(shí)：（L-L1）×（S-S1）=（S1-S2）L1

當(dāng)升高鹽度時(shí)：（L-L1）×（S1-S）=（S2-S1）L1

L2=L-L1

公式中，L為所需配水的數(shù)量（mL）；L1為所需淡水或鹵水的數(shù)量（mL）；L2為所需自然海水的數(shù)量（ mL）；S為自然海水的鹽度（‰）；S1為配水所需達(dá)到的鹽度（‰）；S2為淡水或鹵水的鹽度（‰）。

1.3.4實(shí)驗(yàn)用水溫度的控制將裝有調(diào)配水的燒杯或水桶放入孵化箱或水桶內(nèi)，在孵化箱或水桶內(nèi)放入瓶裝冰降溫或可調(diào)溫控儀的加熱棒調(diào)整所需的溫度。

1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程

通過(guò)陰干、流水、升溫誘導(dǎo)刺激的方式來(lái)采卵[8]。先將蓄養(yǎng)池內(nèi)海水放干，在池底擺好刺參陰干1 h，再用大水流流水刺激0.5 h，然后加高溫水（比蓄養(yǎng)水溫高2～3 ℃），2 h后雄參開(kāi)始排呈一縷乳白色煙霧狀的精液，徐徐散開(kāi)，再過(guò)0.5 h雌參開(kāi)始排出一條桔紅色絨線狀波浪式的卵子，然后慢慢散開(kāi)沉于盆底。

分別取3頭排放量較大的雌參和雄參，分別放入兩個(gè)盛有相同溫度海水的大盆中，讓其分別產(chǎn)卵與排精，不到15 min大盆內(nèi)卵的密度就達(dá)到200粒/mL以上，雄參的盆內(nèi)已經(jīng)看不到底了，分別將親參取出放入產(chǎn)卵池內(nèi)，同時(shí)不斷攪動(dòng)盆內(nèi)的水體，使卵和精液分布均勻，取一定量的精液加入卵的盆內(nèi)并不斷攪水，鏡檢觀察視野內(nèi)一個(gè)卵周圍可見(jiàn)3～5個(gè)精子[9]即可，然后取樣計(jì)數(shù)并觀察卵子受精情況，每個(gè)燒杯內(nèi)受精卵的密度是10粒/mL。

實(shí)驗(yàn)種參產(chǎn)卵時(shí)水溫20～21 ℃、鹽度29‰，實(shí)驗(yàn)分四組：

一組：實(shí)驗(yàn)是在水溫20～21 ℃，鹽度分別控制在10‰、20‰、29‰、40‰、50‰五種條件，每種鹽度下設(shè)三個(gè)燒杯重復(fù)實(shí)驗(yàn)；胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表1、表3。

二組：在鹽度為29‰不變時(shí)，水溫分別控制在12 ℃、20 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃五種條件，每種溫度下設(shè)三個(gè)燒杯進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

三組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入水溫為20～21 ℃，鹽度分別是22‰、27‰、32‰、36‰的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表4。

四組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入鹽度為27‰，水溫分別是15 ℃、20 ℃、28 ℃、30 ℃的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表5。

日常管理：首先每1 h用玻璃棒攪動(dòng)燒杯內(nèi)水體一次，防止受精卵長(zhǎng)時(shí)間沉入杯底，影響孵化率；其次要隨時(shí)觀察各孵化箱內(nèi)的水溫，防止溫差過(guò)大，影響孵化率。

隨時(shí)鏡檢觀察，待胚胎發(fā)育至初耳狀幼體時(shí)期鏡檢定量，具體方法是用量筒將桶水?dāng)噭蛟儆? mL吸管上、中、下層不同位置吸4個(gè)5 mL，共計(jì)20 mL，用甲醛殺死后將幼體全部吸出，用顯微鏡計(jì)數(shù)定量，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

刺參胚胎發(fā)育情況見(jiàn)表1-表5。

表1水溫20～21 ℃，不同鹽度下刺參胚胎發(fā)育狀況

1.3.2實(shí)驗(yàn)用水調(diào)配淡水鹽度為0‰，鹵水的鹽度為290‰。自然海水的鹽度是29‰；實(shí)驗(yàn)的鹽度設(shè)有10‰、20‰、30‰、40‰、50‰以及22‰、27‰、32‰、36‰；低鹽度的海水用自然水（29‰）加淡水調(diào)配，高鹽度的用自然水（29‰）加鹵水調(diào)配。

1.3.3計(jì)算公式

當(dāng)降低鹽度時(shí)：（L-L1）×（S-S1）=（S1-S2）L1

當(dāng)升高鹽度時(shí)：（L-L1）×（S1-S）=（S2-S1）L1

L2=L-L1

公式中，L為所需配水的數(shù)量（mL）；L1為所需淡水或鹵水的數(shù)量（mL）；L2為所需自然海水的數(shù)量（ mL）；S為自然海水的鹽度（‰）；S1為配水所需達(dá)到的鹽度（‰）；S2為淡水或鹵水的鹽度（‰）。

1.3.4實(shí)驗(yàn)用水溫度的控制將裝有調(diào)配水的燒杯或水桶放入孵化箱或水桶內(nèi)，在孵化箱或水桶內(nèi)放入瓶裝冰降溫或可調(diào)溫控儀的加熱棒調(diào)整所需的溫度。

1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程

通過(guò)陰干、流水、升溫誘導(dǎo)刺激的方式來(lái)采卵[8]。先將蓄養(yǎng)池內(nèi)海水放干，在池底擺好刺參陰干1 h，再用大水流流水刺激0.5 h，然后加高溫水（比蓄養(yǎng)水溫高2～3 ℃），2 h后雄參開(kāi)始排呈一縷乳白色煙霧狀的精液，徐徐散開(kāi)，再過(guò)0.5 h雌參開(kāi)始排出一條桔紅色絨線狀波浪式的卵子，然后慢慢散開(kāi)沉于盆底。

分別取3頭排放量較大的雌參和雄參，分別放入兩個(gè)盛有相同溫度海水的大盆中，讓其分別產(chǎn)卵與排精，不到15 min大盆內(nèi)卵的密度就達(dá)到200粒/mL以上，雄參的盆內(nèi)已經(jīng)看不到底了，分別將親參取出放入產(chǎn)卵池內(nèi)，同時(shí)不斷攪動(dòng)盆內(nèi)的水體，使卵和精液分布均勻，取一定量的精液加入卵的盆內(nèi)并不斷攪水，鏡檢觀察視野內(nèi)一個(gè)卵周圍可見(jiàn)3～5個(gè)精子[9]即可，然后取樣計(jì)數(shù)并觀察卵子受精情況，每個(gè)燒杯內(nèi)受精卵的密度是10粒/mL。

實(shí)驗(yàn)種參產(chǎn)卵時(shí)水溫20～21 ℃、鹽度29‰，實(shí)驗(yàn)分四組：

一組：實(shí)驗(yàn)是在水溫20～21 ℃，鹽度分別控制在10‰、20‰、29‰、40‰、50‰五種條件，每種鹽度下設(shè)三個(gè)燒杯重復(fù)實(shí)驗(yàn)；胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表1、表3。

二組：在鹽度為29‰不變時(shí)，水溫分別控制在12 ℃、20 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃五種條件，每種溫度下設(shè)三個(gè)燒杯進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

三組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入水溫為20～21 ℃，鹽度分別是22‰、27‰、32‰、36‰的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表4。

四組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入鹽度為27‰，水溫分別是15 ℃、20 ℃、28 ℃、30 ℃的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表5。

日常管理：首先每1 h用玻璃棒攪動(dòng)燒杯內(nèi)水體一次，防止受精卵長(zhǎng)時(shí)間沉入杯底，影響孵化率；其次要隨時(shí)觀察各孵化箱內(nèi)的水溫，防止溫差過(guò)大，影響孵化率。

隨時(shí)鏡檢觀察，待胚胎發(fā)育至初耳狀幼體時(shí)期鏡檢定量，具體方法是用量筒將桶水?dāng)噭蛟儆? mL吸管上、中、下層不同位置吸4個(gè)5 mL，共計(jì)20 mL，用甲醛殺死后將幼體全部吸出，用顯微鏡計(jì)數(shù)定量，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

刺參胚胎發(fā)育情況見(jiàn)表1-表5。

表1水溫20～21 ℃，不同鹽度下刺參胚胎發(fā)育狀況

1.3.2實(shí)驗(yàn)用水調(diào)配淡水鹽度為0‰，鹵水的鹽度為290‰。自然海水的鹽度是29‰；實(shí)驗(yàn)的鹽度設(shè)有10‰、20‰、30‰、40‰、50‰以及22‰、27‰、32‰、36‰；低鹽度的海水用自然水（29‰）加淡水調(diào)配，高鹽度的用自然水（29‰）加鹵水調(diào)配。

1.3.3計(jì)算公式

當(dāng)降低鹽度時(shí)：（L-L1）×（S-S1）=（S1-S2）L1

當(dāng)升高鹽度時(shí)：（L-L1）×（S1-S）=（S2-S1）L1

L2=L-L1

公式中，L為所需配水的數(shù)量（mL）；L1為所需淡水或鹵水的數(shù)量（mL）；L2為所需自然海水的數(shù)量（ mL）；S為自然海水的鹽度（‰）；S1為配水所需達(dá)到的鹽度（‰）；S2為淡水或鹵水的鹽度（‰）。

1.3.4實(shí)驗(yàn)用水溫度的控制將裝有調(diào)配水的燒杯或水桶放入孵化箱或水桶內(nèi)，在孵化箱或水桶內(nèi)放入瓶裝冰降溫或可調(diào)溫控儀的加熱棒調(diào)整所需的溫度。

1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程

通過(guò)陰干、流水、升溫誘導(dǎo)刺激的方式來(lái)采卵[8]。先將蓄養(yǎng)池內(nèi)海水放干，在池底擺好刺參陰干1 h，再用大水流流水刺激0.5 h，然后加高溫水（比蓄養(yǎng)水溫高2～3 ℃），2 h后雄參開(kāi)始排呈一縷乳白色煙霧狀的精液，徐徐散開(kāi)，再過(guò)0.5 h雌參開(kāi)始排出一條桔紅色絨線狀波浪式的卵子，然后慢慢散開(kāi)沉于盆底。

分別取3頭排放量較大的雌參和雄參，分別放入兩個(gè)盛有相同溫度海水的大盆中，讓其分別產(chǎn)卵與排精，不到15 min大盆內(nèi)卵的密度就達(dá)到200粒/mL以上，雄參的盆內(nèi)已經(jīng)看不到底了，分別將親參取出放入產(chǎn)卵池內(nèi)，同時(shí)不斷攪動(dòng)盆內(nèi)的水體，使卵和精液分布均勻，取一定量的精液加入卵的盆內(nèi)并不斷攪水，鏡檢觀察視野內(nèi)一個(gè)卵周圍可見(jiàn)3～5個(gè)精子[9]即可，然后取樣計(jì)數(shù)并觀察卵子受精情況，每個(gè)燒杯內(nèi)受精卵的密度是10粒/mL。

實(shí)驗(yàn)種參產(chǎn)卵時(shí)水溫20～21 ℃、鹽度29‰，實(shí)驗(yàn)分四組：

一組：實(shí)驗(yàn)是在水溫20～21 ℃，鹽度分別控制在10‰、20‰、29‰、40‰、50‰五種條件，每種鹽度下設(shè)三個(gè)燒杯重復(fù)實(shí)驗(yàn)；胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表1、表3。

二組：在鹽度為29‰不變時(shí)，水溫分別控制在12 ℃、20 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃五種條件，每種溫度下設(shè)三個(gè)燒杯進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。胚胎發(fā)育結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

三組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入水溫為20～21 ℃，鹽度分別是22‰、27‰、32‰、36‰的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表4。

四組：取一些囊胚期的胚胎定量后分別放入鹽度為27‰，水溫分別是15 ℃、20 ℃、28 ℃、30 ℃的各個(gè)水桶里，每桶裝水14 000 mL水，密度為1粒/mL，見(jiàn)表5。

日常管理：首先每1 h用玻璃棒攪動(dòng)燒杯內(nèi)水體一次，防止受精卵長(zhǎng)時(shí)間沉入杯底，影響孵化率；其次要隨時(shí)觀察各孵化箱內(nèi)的水溫，防止溫差過(guò)大，影響孵化率。

隨時(shí)鏡檢觀察，待胚胎發(fā)育至初耳狀幼體時(shí)期鏡檢定量，具體方法是用量筒將桶水?dāng)噭蛟儆? mL吸管上、中、下層不同位置吸4個(gè)5 mL，共計(jì)20 mL，用甲醛殺死后將幼體全部吸出，用顯微鏡計(jì)數(shù)定量，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

刺參胚胎發(fā)育情況見(jiàn)表1-表5。

表1水溫20～21 ℃，不同鹽度下刺參胚胎發(fā)育狀況