錳超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病足傷口的愈合作用

紀(jì)亮 張鵬 沈雷

[摘要] 目的 闡明錳超氧化物歧化酶（MnSOD）轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）對(duì)糖尿病足（DF）的治療作用和機(jī)制，為干細(xì)胞技術(shù)治療疾病奠定研究基礎(chǔ)。方法 鏈脲佐菌素法建立C57BL/6J小鼠糖尿病足模型，分別以2×104 MSC的實(shí)驗(yàn)組（pcDNA3.1-MnSOD轉(zhuǎn)染MSC）、空白質(zhì)粒組（僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1）和對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染者為MSC）進(jìn)行局部注射治療，在7、14 d觀察傷口愈合情況，并分別切取皮膚組織，進(jìn)行CD34免疫組化染色，觀察血管密度變化，ELISA法檢測(cè)各組觀察點(diǎn)的勻漿皮膚組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化還原酶（GSHPX）變化。 結(jié)果 與空白質(zhì)粒組相比，MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組傷口愈合明顯加快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組血管密度比空白質(zhì)粒組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組GSHPX、SOD含量明顯比空白質(zhì)粒組表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）1。結(jié)論 MnSOD轉(zhuǎn)染MSC可以促進(jìn)抗氧化酶類(lèi)表達(dá)增高，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗自由基損傷，加速血管新生和糖尿病足愈合。

[關(guān)鍵詞] 錳超氧化物歧化酶；間充質(zhì)干細(xì)胞；自由基；糖尿病足；血管

[中圖分類(lèi)號(hào)] R730.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）05（b）-0017-03

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）預(yù)測(cè)，2035年全球糖尿病患者將增加到5.92億[1]?；钚匝踉黾邮翘悄虿「哐菗p傷臟器的原因之一[2]，活性氧積累會(huì)使細(xì)胞損傷和傷口新生血管障礙，直接導(dǎo)致肢體皮膚缺血潰瘍，發(fā)生在下肢的缺血性潰瘍?yōu)樘悄虿∽悖―F），該病發(fā)病率為13.5%～16.7%，致殘率為1‰～2.1‰，嚴(yán)重危及患者生命[3]，目前移植MSC到糖尿病傷口，可以通過(guò)促血管新生、毛囊再生等途徑促使傷口愈合[4]，但是MSC自身也受到高血糖的影響，如何在高血糖條件下，促進(jìn)MSC抗自由基作用，發(fā)揮MSC的治療效果，是值得探討的重要課題，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化還原酶（GSHPX）等物質(zhì)，錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和鐵超氧化物歧化酶（FeSOD）等是重要的SOD家族成員，MnSOD在SOD家族中發(fā)揮重要作用，但是高糖條件下通過(guò)MnSOD逆轉(zhuǎn)自由基損害，發(fā)揮對(duì)MSC的保護(hù)作用研究較少[5]。該研究于2012年9月—2013年2月進(jìn)行試驗(yàn)研究，闡明MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，探索MnSOD-MSC促進(jìn)糖尿病足愈合的效果，對(duì)促使MSC細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用廣泛開(kāi)展具有重要經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）購(gòu)自廣州賽業(yè)生物有限公司（廣州，中國(guó)）。用含10% 胎牛血清（FBS，Gbico，USA），1μmol/L青霉素，100 U/mL鏈霉素（Sigma）的α-MEM基本培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC，第3～4代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別在α-MEM基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC實(shí)驗(yàn)組、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染的MSC空白對(duì)照組，各組實(shí)驗(yàn)條件相同。

1.2 MnSOD基因轉(zhuǎn)染MSC

上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)MnSOD基因引物。pcDNA3.1-MnSOD由該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存并提取質(zhì)粒DNA。添加500 μL 1%DNA-Lipofectamine2000，孵育48 h，PBS清洗，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)MnSOD基因的表達(dá)。

1.3 動(dòng)物模型的建立

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按文獻(xiàn)記載[6]，選擇6周齡，體重（21.5±0.5）g的雄性C57BL/6J小鼠（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），以40 mg/kg鏈脲佐菌素，連續(xù)5 d腹腔注射，于7、14、21、28 d尾靜脈檢測(cè)血糖，空腹血糖持續(xù)>16.9 mmol/L為糖尿病小鼠；糖尿病模型成功后，顯微外科手術(shù)分別結(jié)扎股動(dòng)脈起點(diǎn)和在膝關(guān)節(jié)處的分支，多普勒超聲在體檢測(cè)股動(dòng)脈喪失血液供應(yīng)，即為結(jié)扎股動(dòng)脈成功，然后在小鼠大腿后部做一個(gè)5×5 cm的圓形皮膚全層缺損，建立糖尿病足模型，模型鼠在恒溫、恒濕的代謝籠中單獨(dú)飼養(yǎng)[6]。

1.4 糖尿病足的治療以及取材

2×104 MSC、MnSOD-MSC、pcDNA3.1-MSC在糖尿病足傷口周?chē)?、6、9、12點(diǎn)位置注射，3、7、10、14 d觀察愈合效果并取材，每塊組織分為兩份，一份用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫組化等實(shí)驗(yàn)，另一份在-80 ℃保存待用。

1.5 糖尿病足傷口修復(fù)率

在治療后3、7、10、14 d，固定焦距、光圈等參數(shù)，以尼康D90數(shù)碼相機(jī)（日本）拍攝傷口，并以IPP圖像軟件測(cè)量傷口面積，計(jì)算傷口修復(fù)率[6]。傷口修復(fù)率=1-[各觀察點(diǎn)（3、7、10、14 d）測(cè)量傷口面積/ 0 d傷口面積]×100%

1.6 GSHPX、SOD檢測(cè)

收集-80℃保存的各組皮膚組織，0.01 mol/LPBS清洗2遍；冰浴下，用3 mL 50 mM Tris緩沖液（pH=7.5，含1 mM EDTA，10mM DTT，0.2% Triton X-100）裂解細(xì)胞；4 ℃，12 000×g，上清液使用Endogen公司生產(chǎn)的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽還原氧化酶（GSHPX）試劑盒測(cè)定SOD和GSHPX活性[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組MSC表達(dá)MnSOD

Western blot檢測(cè)MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組，MSC對(duì)照組，空白質(zhì)粒組MnSOD蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MnSOD-MSC組有外源性MnSOD表達(dá)，而空質(zhì)粒組和空白組無(wú)MnSOD蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1。

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圖1 MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組，空白質(zhì)粒組，MSC對(duì)照組MnSOD表達(dá)

2.2 糖尿病足愈合情況

相比空質(zhì)粒組，MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組可以明顯加快糖尿病足傷口愈合速度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2。

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A. 各組治療糖尿病足的治愈率（%）。MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組與空質(zhì)粒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.01（n=20）。B.各組典型照片。

圖2 各組治療糖尿病足的效果

2.3 各組SOD、GSHPX變化

空質(zhì)粒組SOD、GSHPX含量較低，MnSOD-MSC實(shí)驗(yàn)組SOD、GSHPX含量與空質(zhì)粒組皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

3 討論

糖尿病傷口延遲愈合的形成與血管匱乏，血液供應(yīng)下降密切相關(guān)，雖然各種治療手段正被用于治療糖尿病潰瘍，但是效果不甚理想，所以促進(jìn)糖尿病足的愈合一直是糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]。傷口愈合時(shí)，各種組織和細(xì)胞、細(xì)胞因子等對(duì)損傷區(qū)進(jìn)行填充[9]，使人們聯(lián)想到干（祖）細(xì)胞的應(yīng)用，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）屬于多潛能干細(xì)胞，具有適應(yīng)局部微環(huán)境，多分化的特點(diǎn)，MSC在心血管損傷、腎功能衰竭、神經(jīng)和骨骼等許多人類(lèi)疾病有廣泛應(yīng)用，對(duì)于DF這種兼有血管、神經(jīng)等混合性病變而言，MSC移植療法尤為合適[10]，該研究也發(fā)現(xiàn)利用MSC可以促使糖尿病足潰瘍愈合，與學(xué)者研究的結(jié)果一致。

糖尿病性高血糖會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈發(fā)生硬化變性，出現(xiàn)微血管梗阻，導(dǎo)致組織局部缺氧而壞死。高血糖乏氧損傷會(huì)通過(guò)NADPH等途徑產(chǎn)生大量活性氧[11]，而糖尿病時(shí)高血糖狀態(tài)促使體內(nèi)抗氧化酶活性降低，機(jī)體清除自由基的能力受損，加重糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，這也是糖尿病足經(jīng)久不愈的原因之一[12]。文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病鼠皮膚MnSOD蛋白等抗氧化酶的活性顯著降低[13]，該研究利用MnSOD轉(zhuǎn)染MSC可以促進(jìn)糖尿病足的愈合，比空轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組具有顯著差別，并證明在體模型上，MnSOD可以促進(jìn)MSC分泌SOD等抗氧化酶類(lèi)，保證MSC對(duì)抗自由基的損傷，達(dá)到促進(jìn)組織修復(fù)的目的[14]。該研究也從側(cè)面驗(yàn)證提高糖尿病足潰瘍周?chē)鶰nSOD蛋白等抗氧化酶的含量，可以對(duì)抗自由基損傷作用，同時(shí)避免MSC等細(xì)胞免受氧自由基的傷害，提示如果利用抗氧化酶轉(zhuǎn)染MSC、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）等干細(xì)胞，會(huì)保護(hù)干（祖）細(xì)胞免受活性氧的傷害，最大程度發(fā)揮細(xì)胞的作用。

雖然利用MnSOD轉(zhuǎn)染MSC治療糖尿病足取得一定效果，但是關(guān)于具體機(jī)制的研究，還需要深入探索，下一步將利用Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)Akt等信號(hào)通路在MnSOD轉(zhuǎn)染的MSC中具體機(jī)制，相關(guān)研究結(jié)果必將為在糖尿病足的干細(xì)胞療法的普及奠定研究基礎(chǔ)，其發(fā)揮的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益非常巨大。

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（收稿日期：2014-02-13）