p-ATM、p-p53及p-p21因子與進(jìn)展期胃癌化療療效及預(yù)后的關(guān)系

洪成雨 鄭 建 李 婷

代謝活動和環(huán)境因素(如紫外線)對機(jī)體的每個細(xì)胞每天的分子損害500，000處之多。DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)是一個高度保守的信號感應(yīng)過程，其必須快速頻繁的運(yùn)行，來修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)上的任何錯誤之處。DDR信號通路被看作是機(jī)體的一道抗癌屏障，如通路中有信號分子發(fā)生突變或調(diào)控異常，細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定性將會增加，自穩(wěn)失衡，增殖失控，促成腫瘤的發(fā)生。我們通過研究其通路中p-ATM、p-p53、p21信號分子與胃癌化療療效的相關(guān)性，為DNA損傷在進(jìn)展期胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能存在的作用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2011年10月我院收治并經(jīng)病理學(xué)檢查證實為進(jìn)展期胃癌患者52例，其中男性28例，女性24例，年齡 42～76歲，平均(58.3±7.2)歲?；颊呔形赴└涡g(shù)，按WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行術(shù)后病理組織學(xué)分型:高分化腺癌9例，中分化腺癌13例，低分化腺癌22例，黏液腺癌8例。納入標(biāo)準(zhǔn):未發(fā)生肺臟、肝臟、腦、骨等器官的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;既往未接受過抗腫瘤治療以及化療;無化療和手術(shù)禁忌癥;病史資料完整;術(shù)后均采用FOLFOX方案化療4個周期。

1.2 主要試劑

p-ATM為鼠抗人單克隆抗體、p-p53為兔抗人多克隆抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司，p21為兔抗人多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，廣譜S-P試劑購自福建邁新技術(shù)公司。

1.3 治療方法

入選患者均采用FOLFOX方案化療:奧沙利鉑130 mg/m2，第1天，靜脈滴注3 h;亞葉酸鈣200 mg/m2，第1～2天，靜脈滴注 1 h;5-氟尿嘧啶，2400 mg/m2，靜脈持續(xù)泵入46 h。3周為1個周期，完成4個周期后判定療效。按WHO實體瘤近期客觀療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評估，分為未進(jìn)展和進(jìn)展，未進(jìn)展為治療有效，進(jìn)展為治療無效。記錄并觀察所有患者從首次化療至病情進(jìn)展或死亡的時間。隨訪截止日期為2012年11月10日。

1.4 免疫組化染色

所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋組織并切片，HE染色，采用免疫組化SP法，正常羊血清室溫封閉10 min，加鼠抗人一抗于4℃過夜，PBS沖洗后加兔抗鼠二抗于室溫下作用30 min，PBS沖洗3×5 min。DAB顯色反應(yīng)，自來水充分沖洗終止反應(yīng)，沖洗后蘇木精復(fù)染、脫水、封固。用已知的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 結(jié)果判斷方法

p-ATM、p-p53及p21蛋白陽性著色均分布于細(xì)胞核，每張切片選擇10個典型的高倍視野(×400)，計數(shù)至少1000個細(xì)胞，結(jié)果以陽性細(xì)胞百分比計算，陽性細(xì)胞率≥10%為陽性(+)，＜10%為陰性(－)。

1.6 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗、χ2檢驗、確切概率法及Pearson相關(guān)分析法，采用Kapan-Meier生存分析法分析無病生存期。

2 結(jié)果

2.1 p-ATM、p-p53及p21表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

p-ATM陽性著色分布癌細(xì)胞核，52例胃癌組織中p-ATM陽性表達(dá)率為36.54%，p-ATM表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)，p-ATM表達(dá)與胃癌病理類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)。p-p53陽性著色分布于癌細(xì)胞核，52例胃癌組織中陽性表達(dá)率為61.54%，p-p53表達(dá)與患者性別、年齡、病理類型、浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)。p21陽性著色分布于癌細(xì)胞核，52例胃癌組織中其陽性表達(dá)率為36.54%，其表達(dá)與患者性別、年齡、浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)，而與其病理類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)，見表1。

表1 p-ATM、p-p53及p21表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.2 p-ATM、p-p53及p21表達(dá)與其療效的關(guān)系

52例初治進(jìn)展期胃癌患者化療4個療程后進(jìn)行觀察，有效34例，無效18例，p-ATM陽性表達(dá)者治療有效率為84.21%，p-ATM陰性表達(dá)者治療有效率為51.52%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。pp53陽性表達(dá)者治療有效率為56.25%，p-p53陰性表達(dá)者治療有效率為80.00%，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。p21陽性表達(dá)者治療有效率為78.95%，p21陰性表達(dá)者治療有效率為57.58%，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表2。

表2 p-ATM、p-p53和p21表達(dá)與胃癌患者療效的關(guān)系/例

2.3 p-ATM、p-p53及p21表達(dá)與胃癌患者無進(jìn)展生存期的關(guān)系

52例進(jìn)展期胃癌患者中位PFS為7個月，其中p-ATM陰性者中位PFS為6個月，p-ATM陽性者中位PFS為8個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1a。p-p53陰性者中位PFS為8個月，pp53陽性者中位PFS為7個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1b。p21陰性者中位PFS為6個月，p21陽性者中位PFS為8個月，兩者PFS比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1c。

圖1 p-ATM、p-p53、p21表達(dá)對化療PFS的影響

2.4 p-ATM、p-p53及p21表達(dá)間的相關(guān)性

本組中p-ATM表達(dá)與p21表達(dá)呈正相關(guān)，p21表達(dá)與p-p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，p-ATM表達(dá)與p-p53表達(dá)無相關(guān)性。

3 討論

3.1 磷酸化蛋白的意義

DNA損傷是指在復(fù)制過程中DNA核苷酸序列發(fā)生了永久性改變，并導(dǎo)致了遺傳特征改變的現(xiàn)象。損傷類型包括:堿基結(jié)構(gòu)的改變、分子間的交聯(lián)、單鏈斷裂、雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)［1-3］。p-ATM(Phospho-ATM(ser1981)protein)是Ser1981磷酸化的ATM(ataxia telangiectasia mutated kinase)蛋白，ATM主要感應(yīng)和識別各種內(nèi)外源性誘變因子造成的DSBs［4-5］。DSBs能夠促使ATM發(fā)生自動磷酸化進(jìn)而快速激活A(yù)TM 激酶［6-7］，所以p-ATM(ser1981)的表達(dá)水平與DSBs損傷的情況具有相關(guān)性。p-p53(Phosphop53(ser15)protein)是Ser15磷酸化的p53蛋白。當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激或受損時p53被活化，為DNA損傷修復(fù)贏得時間，修復(fù)失敗則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，避免細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。p53蛋白在DDR中作為調(diào)控分子，在損傷修復(fù)和凋亡誘導(dǎo)途徑中均發(fā)揮重要作用。p21基因與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，p21在DNA損傷時，使生長周期停滯，DNA 修復(fù)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡［8］。

3.2 磷酸化蛋白表達(dá)與胃癌化療療效的相關(guān)性

我們主要通過免疫組化方法對p-ATM、p-p53、p21與胃癌化療療效的相關(guān)性的研究，探討三者在DNA損傷修復(fù)過程中可能存在的作用。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，p-ATM、p-p53和p21在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為36.54%、61.54%和36.54%。經(jīng) Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，p-ATM表達(dá)與p21表達(dá)呈正相關(guān)，p21表達(dá)與p-p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，p-ATM與p-p53表達(dá)無相關(guān)性。DNA損傷后激活A(yù)TM激酶，ATM快速磷酸化p53，繼而通過p21誘導(dǎo)G1期阻滯。

3.3 磷酸化蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，化療后DNA損傷情況嚴(yán)重，p-ATM與p21高表達(dá)，p-p53表達(dá)較弱。提示，細(xì)胞中可能存在一條通路，其不依賴于p53直接由ATM介導(dǎo)的 p21活化的快速反應(yīng)［9-10］。p-ATM、p-p53和p21的陽性率與患者年齡、性別無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而p-ATM陽性著色位于癌細(xì)胞核與腫瘤的浸潤深度、組織學(xué)分化程度、胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。p-ATM與p21在低分化腺癌類型、浸潤未及漿膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期)高表達(dá)，p21陽性著色位于癌細(xì)胞核中。p-p53陽性著色位于癌細(xì)胞核中，且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期的增加，表達(dá)陽性率也明顯升高。說明炎癥浸潤程度與DNA損傷存在相關(guān)性，炎癥可能加速癌變進(jìn)程［11］。本實驗52位患者均行4個療程FOLFOX方案化療，在此基礎(chǔ)上檢測p-ATM、p-p53和p21與進(jìn)展期胃癌化療療效的關(guān)系。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，化療后臨床療效有效者34例，無效者18例，胃癌組織中p-ATM和p21在陽性表達(dá)初治進(jìn)展期胃癌患者的治療有效率均顯著高于陰性表達(dá)者治療有效率，p-p53陰性表達(dá)者治療有效率為80.00%，p-p53在陰性表達(dá)初治進(jìn)展期胃癌患者的治療有效率均顯著高于陽性表達(dá)者。人類腫瘤組織中常伴隨DSBs的積累［12］，而p-ATM(ser1981)的表達(dá)水平可反映DSBs損傷水平。由此推論，在進(jìn)展期胃癌中也存在DNA DSBs損傷的積累，且ATM和p21蛋白的活化促使了DNA損傷的修復(fù)。

3.4 磷酸化蛋白表達(dá)與化療后生存期的相關(guān)性

本組研究中，中位生存期為7個月，其中p-ATM和p21陰性者中位PFS為6個月，ATM陽性者中位PFS為8個月。經(jīng)單因素Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示p-ATM和p21陽性者的PFS優(yōu)于陰性者，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而p-p53陰性者的PFS優(yōu)于陽性者(P＜0.05)。推測，在胃癌患者化療后DNA發(fā)生損傷，p-ATM和p21可使受損DNA得到修復(fù)，再加上綜合治療來提高患者的生存期。

綜上所述，本研究得出如下結(jié)論:ATM、p53、p21信號通路對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能具有極為重要的作用，可進(jìn)一步深入研究。

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