多菌靈及其雜質(zhì)和代謝物對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性

郇志博 羅金輝

摘 要 分別使用土壤培養(yǎng)法和血細(xì)胞微核試驗(yàn)測(cè)定多菌靈及其雜質(zhì)（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性。結(jié)果表明：多菌靈、2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪和2-氨基苯并咪唑?qū)Τ嘧訍?ài)勝蚯蚓7 d的LC50分別為8.60、14.84、18.92和27.72 mg/kg干土，多菌靈對(duì)蚯蚓的毒性為中毒，其他3種化合物為低毒。微核試驗(yàn)結(jié)果表明：多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛(ài)勝蚯蚓血細(xì)胞產(chǎn)生微核，并且隨著暴露劑量和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)微核率增加；其他3種物質(zhì)在測(cè)定劑量和測(cè)定時(shí)間下，微核率與空白對(duì)照差異不顯著。

關(guān)鍵詞 多菌靈 ；2，3-二氨基酚嗪 ；2-氨基-3-羥基酚嗪 ；2-氨基苯并咪唑 ；急性毒性 ；遺傳毒性

分類(lèi)號(hào) X171.5

多菌靈是一種內(nèi)吸性苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，常用于防治多種真菌性病害，如炭疽病、霜霉病、銹病、瘡痂病、褐斑病等，在果蔬、茶葉和觀賞植物上廣泛應(yīng)用[1]。中國(guó)年產(chǎn)多菌靈原藥超過(guò)1萬(wàn) t，占中國(guó)殺菌劑總量的1/4[2]。截止2012年7月， 中國(guó)共有857家農(nóng)藥廠登記各種多菌靈的單一及復(fù)配制劑，且多菌靈還是其他苯并咪唑類(lèi)殺菌劑（如：苯菌靈、噻菌靈和托布津等）的活性成分和代謝產(chǎn)物[3]，多菌靈降解速度緩慢，在土壤中培養(yǎng)250 d后，仍會(huì)有5%～13%的多菌靈殘存于土壤中[4]，而且多菌靈在水果、蔬菜中殘留超標(biāo)的情況也時(shí)有發(fā)生[5-6]。

2012年1月，美國(guó)可口可樂(lè)公司和百事公司的橙汁產(chǎn)品檢出極少量殺菌劑多菌靈，由于多菌靈可疑的損傷遺傳物質(zhì)的作用，引起全球范圍的“果汁”恐慌[7]。2012年4月國(guó)際環(huán)保組織“綠色和平”調(diào)查北京、成都和海口的9個(gè)茶葉品牌，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)18份茶葉有14份含有多菌靈等可能影響生育能力、胎兒發(fā)育或可能損害遺傳基因的殘留農(nóng)藥[8]。

20世紀(jì)80年代就有關(guān)于多菌靈的毒性報(bào)道，至90年代，多菌靈已被世界衛(wèi)生組織列為可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。多菌靈的大鼠急性經(jīng)口LC50>15 000 mg/kg，經(jīng)皮LC50>2 000 mg/kg，小鼠口服LC50為5 000 mg/kg，按中國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于低毒殺菌劑[9]。但多菌靈是否具有遺傳毒性，眾說(shuō)紛紜。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大量喂食含多菌靈的飼料可以提高小鼠肝臟良、惡性腫瘤的發(fā)病率，且與給藥量有著明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；另一些學(xué)者卻研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈可能不是一種致突變物，因?yàn)榻o大鼠喂食含1 000 mg/kg多菌靈的飼料4個(gè)月，結(jié)果顯示為陰性[9]。曹柳燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈的致癌性與雜質(zhì)2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）有關(guān)，通過(guò)改善多菌靈的生產(chǎn)工藝，可以減少雜質(zhì)含量，降低多菌靈的遺傳毒性；于功昌等[9]認(rèn)為，多菌靈的致癌性與其代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（2-氨基苯并咪唑）有關(guān)。因此，弄清多菌靈是否具有遺傳毒性以及其遺傳毒性與雜質(zhì)和代謝物的關(guān)系，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者的健康和保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物和藥劑

赤子愛(ài)勝蚯蚓（Eisenia foetida）購(gòu)自天津賈立明養(yǎng)殖公司，每條體重約200～300 mg，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)培養(yǎng)，環(huán)帶明顯、大小基本一致的健康成蚓，試驗(yàn)前清腸24 h。

多菌靈、2，3-二氨基酚嗪（DAP）、2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）和2-氨基苯并咪唑標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SIGMA公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備和條件

光學(xué)顯微鏡（YS100，尼康）；光照培養(yǎng)箱（HPG-280B，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。

試驗(yàn)用人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、68%石英砂和2%碳酸鈣組成，充分混勻后待用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

參照劉偉等[11]的研究方法，先做預(yù)試驗(yàn)，求出各種化合物對(duì)蚯蚓7 d全致死的最低濃度和全存活的最高濃度，在此范圍內(nèi)設(shè)置5個(gè)處理組，設(shè)立溶劑對(duì)照和空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。先將丙酮配制的系列濃度的化合物與10 g人工土壤混勻，待丙酮充分揮發(fā)后，再與490 g人工土壤充分混勻，調(diào)節(jié)水分，使其含水量約為30%，然后放入蚯蚓，置于2 L燒杯中，用塑料薄膜封口，并用解剖針在薄膜上扎孔，置（20±1）℃、濕度80%～85%的培養(yǎng)箱中，400～800 Lx光強(qiáng)連續(xù)光照，于第7天倒出瓶?jī)?nèi)土壤，記錄蚯蚓死亡數(shù)（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無(wú)反應(yīng)則為死亡），及時(shí)清除死蚯蚓。根據(jù)蚯蚓7 d的死亡率，求出各個(gè)化合物對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限。

1.2.2 微核試驗(yàn)

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)各個(gè)化合物的LC50值，設(shè)置多菌靈試驗(yàn)濃度為0.4、1.2、3.6 mg/kg干土；2，3-二氨基酚嗪濃度、2-氨基-3-羥基酚嗪濃度為0.6、1.8、5.4 mg/kg干土；2-氨基苯并咪唑濃度為0.8、2.4、7.2 mg/kg干土。設(shè)置空白（水）對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照（絲裂霉素）0.4 mg/kg干土，染毒方法同急性毒性試驗(yàn)方法，于處理后的第7、14、21天取出蚯蚓，制備血細(xì)胞涂片并進(jìn)行顯微觀察，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。

將染毒后的蚯蚓浸入蒸餾水中并逐滴加入濃度為95%酒精，使蚯蚓麻醉，然后用濾紙吸干多余液體，用小剪刀將蚯蚓的背部剪破后取血，迅速涂片，晾干，甲醇固定15 min，15% Giemsa染色液（用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，pH 6.8）染色15 min，用去離子水沖洗，電熱吹風(fēng)吹干，400倍顯微鏡觀察。每個(gè)重復(fù)取2條蚯蚓，每條蚯蚓制備1張涂片，每張涂片觀察約500個(gè)血細(xì)胞，記錄微核細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算微核率，觀察結(jié)果以千分率表示。微核判斷標(biāo)準(zhǔn)：位于有核血細(xì)胞胞漿中，與主核完全分開(kāi)，呈圓形或橢圓形藍(lán)紫色顆粒，邊緣光滑，染色性質(zhì)與主核一致，大小為主核的1/3以下[12]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)不同濃度下的死亡率，使用軟件SPSS16.0的Probit模型計(jì)算各個(gè)化合物對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限；微核率的結(jié)果表示為[平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）]，使用SPSS的單因素方差分析法分析不同濃度處理區(qū)組間差異，若差異明顯，用SPSS的最小顯著極差法（LSD）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種物質(zhì)對(duì)蚯蚓的急性毒性

4種物質(zhì)土壤染毒后蚯蚓的中毒癥狀類(lèi)似：低濃度下，體色變暗，卷曲、僵硬，生殖環(huán)腫脹，高濃度處理后蚯蚓背部出現(xiàn)水泡、滲血現(xiàn)象，隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度處理組蚯蚓滲血現(xiàn)象嚴(yán)重，生殖環(huán)潰爛，體節(jié)延長(zhǎng)，蚯蚓尾部有斷節(jié)現(xiàn)象。

蚯蚓是評(píng)價(jià)化學(xué)農(nóng)藥安全性的一種重要的指示生物。目前中國(guó)劃定的農(nóng)藥對(duì)蚯蚓毒性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為高毒（LC50≤1 mg/kg干土），中毒（1 mg/kg干土10 mg/kg干土）（《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》）。由表1可知，多菌靈LC50為8.60 mg/kg干土為中毒，2，3-二氨基酚嗪LC50為14.84 mg/kg干土為低毒，2-氨基-3-羥基酚嗪LC50為18.92 mg/kg干土為低毒，2-氨基苯并咪唑LC50為27.72 mg/kg干土為低毒。

2.2 微核試驗(yàn)

表2數(shù)據(jù)表明，隨著多菌靈濃度的升高，在相同的染毒時(shí)間內(nèi)，蚯蚓血細(xì)胞的微核率顯著性升高。在同一濃度下，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，蚯蚓血細(xì)胞的微核率也有所提高（P<0.05），空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。通過(guò)400倍的顯微鏡觀察，多菌靈誘導(dǎo)的蚯蚓血細(xì)胞微核清晰可見(jiàn)（圖1）。表2、3和4表明，多菌靈的2種雜質(zhì)2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羥基酚嗪（HAP）和1種代謝物2-氨基苯并咪唑?qū)︱球狙?xì)胞微核的誘導(dǎo)作用與空白對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05），而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其微核率與空白對(duì)照相比差異也不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論

微核是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用后，在有絲分裂過(guò)程中形成的落后染色體、染色體橋、染色斷片、環(huán)狀染色體等在末期以后形成的1個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核。一般產(chǎn)生的微核數(shù)與外界誘變因子的強(qiáng)弱成正比，所以可用微核出現(xiàn)的千分率來(lái)評(píng)價(jià)污染物對(duì)生物遺傳物質(zhì)影響的程度，微核率已被國(guó)際誘變劑、致癌劑保護(hù)委員會(huì)推薦為檢查致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理方法之一[13]。

至于多菌靈誘導(dǎo)產(chǎn)生微核的機(jī)理，黎杰強(qiáng)等[13]通過(guò)蠶豆微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多菌靈一是通過(guò)干擾有絲分裂過(guò)程中紡錘體的形成，引起細(xì)胞不能正常有絲分裂，致使一到數(shù)條染色體在有絲分裂后期不能進(jìn)入細(xì)胞核，而單獨(dú)留在細(xì)胞質(zhì)中形成微核；二是多菌靈直接導(dǎo)致染色體斷裂和粘連。吳麗明等[14]通過(guò)對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞的染色體觀察發(fā)現(xiàn)，多菌靈能誘發(fā)小鼠精母細(xì)胞染色體畸變率增加，畸變的類(lèi)型有形成染色體斷片、環(huán)狀四價(jià)體和鏈狀四價(jià)體等。

本研究表明：多菌靈對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的毒性等級(jí)為中毒，雜質(zhì)（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓為低毒；多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛(ài)勝蚯蚓血細(xì)胞產(chǎn)生微核，并且隨著暴露劑量和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)微核率增加，因此多菌靈是一種潛在的誘變劑和致癌劑；建議目前的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在關(guān)注農(nóng)藥殘留的急性毒性的同時(shí)，加強(qiáng)關(guān)注多菌靈類(lèi)似農(nóng)藥的誘變作用和致癌作用；另外雜質(zhì)（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪）和代謝物（2-氨基苯并咪唑）對(duì)蚯蚓血細(xì)胞染色體畸變的誘導(dǎo)作用不明顯，因此多菌靈的致癌致畸作用可能與這幾種物質(zhì)無(wú)關(guān)。

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