EV71病毒引起手足口病患兒免疫狀態(tài)變化的研究

柯江維，陳強(qiáng)，段榮，朱慶雄，劉洪，鄒崢

(江西省兒童醫(yī)院，江西 南昌 330006)

Enterovirus 71(EV71)屬細(xì)小RNA病毒科腸道病毒屬病毒，是手足口病 (hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體[1]。該病毒具有明顯嗜皮膚和嗜神經(jīng)特性，其臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，重者表現(xiàn)為腦膜腦炎、腦脊髓炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等，甚至死亡。導(dǎo)致重癥EV71感染的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，推測(cè)可能與病毒直接侵犯組織細(xì)胞(如腦組織)或病毒膿毒癥所致異常免疫反應(yīng)有關(guān)[1]。本文就EV71病毒引起的手足口病患兒細(xì)胞免疫、體液免疫和部分細(xì)胞因子的變化進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)這些免疫功能狀態(tài)的變化與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2010年5月至2011年9月在江西省兒童醫(yī)院住院的手足口病患兒(病例組)，經(jīng)核酸檢測(cè)EV71陽(yáng)性患者220例,其中男127例、女93例；年齡4月～6歲，平均年齡(2.4±0.72)歲。臨床診斷、分型及治療均符合衛(wèi)生部頒布的手足口病預(yù)防控制指南(2010版)的規(guī)范[2]。其中普通患兒(普通組)117例,重癥患兒(重癥組)103例(重型：60例，危重型43例)。所有病例均無(wú)其他慢性疾病史，入組前未經(jīng)任何治療，這些患兒均按照臨床表現(xiàn)及病情發(fā)展予以分期；同時(shí)收集206例健康兒童為對(duì)照組，其中男119例,女87例,年齡5個(gè)月～7歲,平均年齡(2.5±0.67)歲。病例組和健康對(duì)照組年齡、性別、體重相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 臨床特征 重癥HFMD均有腦炎并發(fā)癥，如單純并發(fā)腦炎、并發(fā)腦炎和肺炎及上呼吸道感染等其他并發(fā)癥。重型組主要是指有發(fā)熱、皮疹、神經(jīng)系統(tǒng)受累，主要表現(xiàn)為嗜睡、易驚、肢體抖動(dòng)、陣發(fā)性抽搐等。危重型組主要是指表現(xiàn)為高熱 (體溫39.0℃以上)，持續(xù)2～7d；患兒病情較危重，出現(xiàn)頻繁抽搐和嚴(yán)重意識(shí)障礙，同時(shí)伴有循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)受累表現(xiàn)。

1.3 方法 病例組和對(duì)照組盡可能在同一時(shí)段采集靜脈血4ml，其中2ml置普通管離心，分別用化學(xué)發(fā)光分析儀(Immulite1000，德國(guó)西門(mén)子公司)檢測(cè)白介素-13(IL-13)和干擾素-γ(IFN-γ)；特定蛋白分析儀 (BNP，德國(guó)西門(mén)子公司)檢測(cè)免疫球蛋白(IgG、IgA和 IgM)；剩余2ml置于EDTA-K2抗凝管，立即用六色流式細(xì)胞儀 (FACSCanto，美國(guó)BD公司)檢測(cè)T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的相對(duì)含量。以上所有試劑都配套，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手足口三型與健康對(duì)照組IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量變化 手足口三型與健康對(duì)照組比較，五項(xiàng)指標(biāo)都增高，除普通型的IgG、IgA沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外，其它都差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；而手足口三型之間比較，隨著病情的加重，五項(xiàng)指標(biāo)的濃度也不斷增高，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 見(jiàn)表1。

表1 手足口三型與健康對(duì)照組IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量(±s)

表1 手足口三型與健康對(duì)照組IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量(±s)

注：與健康對(duì)照組比較，△P＜0.01；與普通型組比較，▲P＜0.01；與重型組比較，※P＜0.01。

組別 例數(shù) IgG(g/L) IgA(g/L) IgM(g/L) IL-13(ng/L) IFN-γ(ng/L)普通型組重型組危重型組健康對(duì)照組117 60 43 206 7.83±1.25 10.86±2.15△▲15.14±3.10△▲※7.78±2.41 0.81±0.40 1.50±0.47△▲1.76±0.53△▲※0.76±0.37 1.37±0.32△1.74±0.21△▲2.05±0.46△▲※1.10±0.51 37.21±7.85△59.12±10.43△▲70.27±9.13△▲※26.43±6.76 37.21±7.85△59.12±10.43△▲70.27±9.13△▲※26.43±6.76

2.2 手足口三型與健康對(duì)照組T細(xì)胞亞群 (CD3+、CD4+、CD8+)、B 細(xì)胞(CD19+)和 NK(CD16+56+)細(xì)胞的相對(duì)含量變化 普通型組與健康對(duì)照組比較CD3+、CD4+、CD8+稍微增高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CD16+56+、CD19+增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；其它兩型與健康對(duì)照組比較， CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+的含量都顯著降低，而CD19+顯著增高，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；CD4+/CD8+的比值無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。手足口三型之間比較， 隨著病情的加重，CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+的含量的不斷降低，而CD19+不斷增高，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

3 討論

兒童是一類特殊的群體，其免疫系統(tǒng)功能的發(fā)育與成人相比尚不健全，這就成為病原微生物進(jìn)攻機(jī)體的一個(gè)重要突破口。兒童，特別是嬰幼兒，是處于生理性免疫低下的狀態(tài)，固有免疫及適應(yīng)性免疫功能均較成人差，這也可能是手足口病易感于5歲以下兒童的重要原因[3]。研究指出，淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能中最重要的一類細(xì)胞，是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[4]。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，末梢血淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成為功能不同的亞群，T、B、NK細(xì)胞。當(dāng)亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，就能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。尤其是T淋巴細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的數(shù)量和相對(duì)比值的變化在免疫系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位[5]，CD4+與CD8+淋巴細(xì)胞兩者相互誘導(dǎo)、相互制約形成T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和維持免疫的自穩(wěn)性。當(dāng)T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失衡時(shí)，造成抑制性T細(xì)胞(Ts)功能和分化異常，Ts有可能通過(guò)釋放抑制因子抑制效應(yīng)T細(xì)胞活化，從而造成機(jī)體免疫功能紊亂[6]。

表2 手足口三型與健康對(duì)照組 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和 CD16+56+的含量(±s，%)

表2 手足口三型與健康對(duì)照組 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和 CD16+56+的含量(±s，%)

注：與健康對(duì)照組比較，△P＜0.01；與普通型組比較，▲P＜0.01；與重型組比較，※P＜0.01。

組別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD16+56+ CD19+普通型組重型組危重型組健康對(duì)照組117 60 43 206 64.48±4.82 48.53±8.12△▲41.58±7.11△▲※63.53±6.82 39.72±3.60 27.68±6.56△▲22.04±5.86△▲※38.78±4.81 27.30±4.08 20.59±3.70△▲15.59±3.16△▲※26.32±3.17 1.43±0.42 1.37±0.40 1.28±0.37 1.45±0.33 25.32±5.34△10.43±4.36△▲6.78±3.35△▲※20.21±10.34 22.12±9.30△30.15±11.34△▲40.23±12.57△▲※18.67±8.73

然而，在感染的早期一般是以固有免疫反應(yīng)為主，表現(xiàn)在NK細(xì)胞百分比升高，當(dāng)發(fā)展至危重癥時(shí)，固有免疫的作用已不能使疾病恢復(fù)，受某些固有免疫分子的指引，啟動(dòng)不同類型的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[7],主要原因是NK細(xì)胞是一類特殊性質(zhì)的細(xì)胞群體，無(wú)需抗原的預(yù)先刺激與活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒作用，并分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IFN、TNF、IL-13等。

從本實(shí)驗(yàn)HFMD普通組來(lái)看，首先是NK細(xì)胞和兩個(gè)炎性分子升高，T細(xì)胞亞群變化不明顯，B細(xì)胞也同時(shí)啟動(dòng)，說(shuō)明是固有免疫在發(fā)揮抗EV71病毒的作用，但隨著病情的加重，HFMD患兒T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞均明顯下降，B淋巴細(xì)胞明顯增高，提示患兒機(jī)體的細(xì)胞免疫功能降低，不能有效抵御病毒感染，殺滅受感染的細(xì)胞，隨即啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，可能導(dǎo)致病程延長(zhǎng)，而病程的延長(zhǎng)又使機(jī)體免疫功能進(jìn)一步受損，發(fā)生極其復(fù)雜的免疫功能變化，輕癥患兒處于全身炎性反應(yīng)綜合征，重癥患者處于代償性抗炎性反應(yīng)或混合性拮抗反應(yīng)狀態(tài)。有證據(jù)表明這些都與EV71可通過(guò)凋亡CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞及 NK 細(xì)胞而抑制細(xì)胞免疫有關(guān)[8]。至于隨著病情加重，HFMD患兒外周血B淋巴細(xì)胞明顯增高，可能與機(jī)體增強(qiáng)抗病毒抗體中和病毒作用有關(guān)。在HFMD普通型患兒，由于病情較輕，同時(shí)有增高的NK細(xì)胞保護(hù)，機(jī)體適應(yīng)性免疫(B細(xì)胞)只是輔助，故我們只檢測(cè)到初次體液免疫反應(yīng)時(shí)起主要作用的免疫球蛋白IgM增高。而隨著病情加重，患兒進(jìn)入到重癥期時(shí)，T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例不斷下降，細(xì)胞免疫進(jìn)一步受損，適應(yīng)性免疫(B細(xì)胞)可能起更大作用，由此引發(fā)的抗體和炎性因子會(huì)大量增加。正如我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到的，HFMD重型和危重型患兒的 IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ異常增高，特別是危重型患兒，檢測(cè)值更是遠(yuǎn)離健康對(duì)照組和普通型組，如有1例神經(jīng)源性肺水腫的危重型患兒的IgG大于30g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：隨著HFMD病情的加重，患兒血清免疫球蛋白水平會(huì)出現(xiàn)明顯改變，表明在手足口病重癥期，患兒體內(nèi)出現(xiàn)免疫功能亢進(jìn)，產(chǎn)生大量的免疫球蛋白來(lái)保護(hù)機(jī)體、促使病情的恢復(fù)，但同時(shí)又會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的免疫傷害，使患兒的病情進(jìn)一步向危重癥發(fā)展。這也是HFMD患兒在急性感染期體內(nèi)的體液免疫及細(xì)胞免疫均被激活，但過(guò)度激活的體液免疫及激活不足的細(xì)胞免疫相爭(zhēng)相抗的局面造成的。

至于細(xì)胞因子又是如何參與病情的發(fā)展過(guò)程？實(shí)驗(yàn)中只對(duì)兩個(gè)代表性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-13進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，HFMD三型患兒血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-13均升高，并且隨著病情加重而增加，提示介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)。許多研究者[9-11]指出，正常情況下體內(nèi)細(xì)胞因子間相互制約，共同維護(hù)免疫平衡，且含量很低。EV71病毒侵入機(jī)體后，免疫細(xì)胞被激活分泌細(xì)胞因子，細(xì)胞因子一方面參與機(jī)體免疫防護(hù)，另一方面也參與機(jī)體免疫病理?yè)p傷。IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌的，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，而細(xì)胞免疫在抗病毒反應(yīng)中起著主要作用；IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，抑制Th1細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞增殖和活化，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖和活化，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。二者分別增高，相互拮抗，共同促進(jìn)病情發(fā)展。

縱觀全文，EV71感染所致HFMD患兒出現(xiàn)細(xì)胞免疫、體液免疫和先天性免疫功能紊亂，并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。提示HFMD患兒入院時(shí)應(yīng)及時(shí)檢測(cè)這三大免疫功能指標(biāo)，并監(jiān)測(cè)這些指標(biāo)的變化。若患兒T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞含量逐漸降低，B淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白含量及IFN-γ、IL-13明顯增高或逐漸增高時(shí)，要引起重視，進(jìn)行積極的干預(yù)，防止疾病可能向重癥、危重癥轉(zhuǎn)變，甚至出現(xiàn)死亡。

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