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    一株枯草芽胞桿菌的分離鑒定及其殺蟲活性的研究

    2014-11-14 15:48劉慰秦浩劉霜

    劉慰+秦浩+劉霜+等

    摘要以從土壤中自行分離的219株芽胞桿菌中篩選的一株枯草芽胞桿菌菌株HX08為研究對(duì)象,通過菌落形態(tài)觀察、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等進(jìn)行菌體形態(tài)觀察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鑒定,該株細(xì)菌屬枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis,命名為HX08,并將其16S rRNA基因序列提交上Genebank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得登陸號(hào)KF774302.通過生測(cè)發(fā)現(xiàn),HX08菌株在60 h發(fā)酵時(shí)間段對(duì)棉鈴蟲的致死效果最好.對(duì)該菌株發(fā)酵液提取的活性蛋白進(jìn)行初步研究,建立了HPLC技術(shù)分離體系,使用H2O做流動(dòng)相,以0.5 mL/min 流速洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)分別為215、254和280 nm,收集第15 mL收集管處即保留時(shí)間為31 min的2號(hào)峰粗分離物活性較高.切取SDSPAGE膠上相對(duì)應(yīng)活性峰目的蛋白質(zhì)條帶酶解,利用質(zhì)譜( LTQMS) 技術(shù)進(jìn)行了分子特性分析,鑒定發(fā)現(xiàn)殺蟲活性蛋白成分為草酸脫羧酶.

    關(guān)鍵詞枯草芽胞桿菌;菌株鑒定;生理生化特性;殺蟲活性

    中圖分類號(hào)S476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537(2014)05001407

    枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)具有典型的芽胞桿菌特征,是一類好氧、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌[1],作為一種有益的土壤細(xì)菌,對(duì)人畜相對(duì)安全,發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和抗逆生長(zhǎng)的孢子都讓其對(duì)多種病原菌產(chǎn)生拮抗作用[2].枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的分離純化及抗菌作用的分子機(jī)制、拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控等研究已經(jīng)積累了豐富的資料,所篩得的拮抗菌株數(shù)量也較多,但是應(yīng)用到殺蟲方面的菌株較少,潛力有待發(fā)掘[3].鑒于目前農(nóng)作物生產(chǎn)中存在的病蟲害防治問題,本研究從本地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),力求獲得適合本地區(qū)的對(duì)鱗翅目害蟲具有高效殺蟲活性的枯草芽胞桿菌,為開發(fā)該菌的生物防治功能和擴(kuò)大農(nóng)作物應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ).

    3討論

    根據(jù)該菌在平板上的菌落形態(tài),初步推斷為芽胞桿菌類,故采用高溫法篩選,優(yōu)化了菌株的分離過程,提高了分離效率.本研究通過一系列方法,對(duì)從湖南長(zhǎng)沙市采集到的土樣中利用高溫條件篩選到的219株芽胞桿菌中,分離得到一株新菌株并進(jìn)行了鑒定和歸類.將測(cè)得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜尋,該株菌與Bacillus subtilis strain CU12(JX489167.1)具有很高相似性,序列相似性為99%,可認(rèn)為屬于枯草芽胞桿菌中一個(gè)新的菌株(HX08).

    研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis在低pH環(huán)境下也可以誘導(dǎo)合成草酸脫羧酶[78],枯草芽胞桿菌生防菌株Bs916 可產(chǎn)生抗菌蛋白對(duì)核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum) 和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) 的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,隨后鑒定該蛋白為草酸脫羧酶[910].該酶單體結(jié)構(gòu)含有2個(gè)結(jié)構(gòu)相似的cupin結(jié)構(gòu)域, 并且在每個(gè)域的中心部位含有一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn), 和周圍的氨基酸殘基結(jié)合成為雙核中心, 另外它的N末端還含有短螺旋突出肽鏈[8],該酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在結(jié)構(gòu)域II的結(jié)合位點(diǎn)上[1116],本研究分離出的活性物質(zhì)的具體殺蟲機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究.HX08菌株60 h的發(fā)酵液殺蟲效果更為明顯,說明進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后菌株的殺蟲活性物質(zhì)仍然繼續(xù)增加,能提高殺蟲效果.鑒于目前市場(chǎng)很少有能有效防治鱗翅目害蟲的枯草芽胞桿菌微生物制劑[1718],本實(shí)驗(yàn)分離出對(duì)棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有致死毒力的殺蟲菌株,對(duì)研究草酸脫羧酶殺蟲作用分子機(jī)制及研發(fā)新型殺蟲劑提供了重要基礎(chǔ),為生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐.

    參考文獻(xiàn):

    [1]劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2002.

    [2]李明,雙寶,李海濤,等.枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,40(9):111114.

    [3]程洪斌,劉曉橋,陳紅漫.枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006,22(1):109112.

    [4]溫海燕.枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J].獸醫(yī)科技, 2012(3):118119.

    [5]曹茂新,洪楓,朱利民.草酸脫羧酶及其應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志, 2005 ,25(Z):170175.

    [6]LIU Y, CHEN Z, NG T B, et al. Bacisubin, an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B916[J]. Peptides, 2007,28(3):553559.

    [7]劉永鋒,陳志誼,周明國(guó),等. 枯草芽孢桿菌Bs916 的抑菌活性及其抑菌物質(zhì)初探[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007,9(1):92954.

    [8]于俊杰,陳志誼,胡建坤,等. 枯草芽孢桿菌Bs916 草酸脫羧酶基因Bacisubin 的克隆、原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012,28(3):497502.

    [9]李林珂,高玉千,崔錦,等. 一株蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006(3):5052.

    [10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社, 1999:370384.

    [11]BANERJEE A B, BOSE S K. Aminoacid configuration of mycobacillin[J]. Nature, 1963,200:471.

    [12]TAMEHIRO N , OKAMOTO Y, OKAMOTO S, et al. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Antimicrob agents chemother, 2002,46:315320.

    [13]沈錦玉,尹文林,曹錚,等.枯草芽孢桿菌B115抗菌蛋白的分離純化及部分性質(zhì)[J].水生生物學(xué)報(bào), 2005,29(6):689693.

    [14]白延琴,辛小玲, 來有志,等.枯草芽孢桿菌的分離篩選[J].畜牧獸醫(yī)雜志, 2013,32(2):2427,31.

    [15]BESSON F, MICHEL G. Isolation and characterization of new iturins: iturin D and iturin E[J]. J Antibiotics, 1987,40(4):437 442.

    [16]DELEU M, PAQUOT M, NY LANDER. Fengycin interaction with lipidmono layers at the air aqueous interface implications for the effect of fengycin on b iologicalm emb ranes[J]. Colloid Interface Sci, 2005,283(2):358365.

    [17]陳志誼,許志剛,陸凡,等. 拮抗細(xì)菌B916 培養(yǎng)液對(duì)水稻紋枯病菌的抗生活性及其抗菌物質(zhì)的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2000,16(3):148152.

    [18]羅楚平,陳志誼,劉永鋒,等. 生防菌Bs916 合成脂肽類化合物Bac 操縱子突變株構(gòu)建及功能[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2009,49(4):445452.

    (編輯王?。?

    摘要以從土壤中自行分離的219株芽胞桿菌中篩選的一株枯草芽胞桿菌菌株HX08為研究對(duì)象,通過菌落形態(tài)觀察、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等進(jìn)行菌體形態(tài)觀察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鑒定,該株細(xì)菌屬枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis,命名為HX08,并將其16S rRNA基因序列提交上Genebank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得登陸號(hào)KF774302.通過生測(cè)發(fā)現(xiàn),HX08菌株在60 h發(fā)酵時(shí)間段對(duì)棉鈴蟲的致死效果最好.對(duì)該菌株發(fā)酵液提取的活性蛋白進(jìn)行初步研究,建立了HPLC技術(shù)分離體系,使用H2O做流動(dòng)相,以0.5 mL/min 流速洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)分別為215、254和280 nm,收集第15 mL收集管處即保留時(shí)間為31 min的2號(hào)峰粗分離物活性較高.切取SDSPAGE膠上相對(duì)應(yīng)活性峰目的蛋白質(zhì)條帶酶解,利用質(zhì)譜( LTQMS) 技術(shù)進(jìn)行了分子特性分析,鑒定發(fā)現(xiàn)殺蟲活性蛋白成分為草酸脫羧酶.

    關(guān)鍵詞枯草芽胞桿菌;菌株鑒定;生理生化特性;殺蟲活性

    中圖分類號(hào)S476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537(2014)05001407

    枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)具有典型的芽胞桿菌特征,是一類好氧、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌[1],作為一種有益的土壤細(xì)菌,對(duì)人畜相對(duì)安全,發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和抗逆生長(zhǎng)的孢子都讓其對(duì)多種病原菌產(chǎn)生拮抗作用[2].枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的分離純化及抗菌作用的分子機(jī)制、拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控等研究已經(jīng)積累了豐富的資料,所篩得的拮抗菌株數(shù)量也較多,但是應(yīng)用到殺蟲方面的菌株較少,潛力有待發(fā)掘[3].鑒于目前農(nóng)作物生產(chǎn)中存在的病蟲害防治問題,本研究從本地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),力求獲得適合本地區(qū)的對(duì)鱗翅目害蟲具有高效殺蟲活性的枯草芽胞桿菌,為開發(fā)該菌的生物防治功能和擴(kuò)大農(nóng)作物應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ).

    3討論

    根據(jù)該菌在平板上的菌落形態(tài),初步推斷為芽胞桿菌類,故采用高溫法篩選,優(yōu)化了菌株的分離過程,提高了分離效率.本研究通過一系列方法,對(duì)從湖南長(zhǎng)沙市采集到的土樣中利用高溫條件篩選到的219株芽胞桿菌中,分離得到一株新菌株并進(jìn)行了鑒定和歸類.將測(cè)得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜尋,該株菌與Bacillus subtilis strain CU12(JX489167.1)具有很高相似性,序列相似性為99%,可認(rèn)為屬于枯草芽胞桿菌中一個(gè)新的菌株(HX08).

    研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis在低pH環(huán)境下也可以誘導(dǎo)合成草酸脫羧酶[78],枯草芽胞桿菌生防菌株Bs916 可產(chǎn)生抗菌蛋白對(duì)核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum) 和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) 的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,隨后鑒定該蛋白為草酸脫羧酶[910].該酶單體結(jié)構(gòu)含有2個(gè)結(jié)構(gòu)相似的cupin結(jié)構(gòu)域, 并且在每個(gè)域的中心部位含有一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn), 和周圍的氨基酸殘基結(jié)合成為雙核中心, 另外它的N末端還含有短螺旋突出肽鏈[8],該酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在結(jié)構(gòu)域II的結(jié)合位點(diǎn)上[1116],本研究分離出的活性物質(zhì)的具體殺蟲機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究.HX08菌株60 h的發(fā)酵液殺蟲效果更為明顯,說明進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后菌株的殺蟲活性物質(zhì)仍然繼續(xù)增加,能提高殺蟲效果.鑒于目前市場(chǎng)很少有能有效防治鱗翅目害蟲的枯草芽胞桿菌微生物制劑[1718],本實(shí)驗(yàn)分離出對(duì)棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有致死毒力的殺蟲菌株,對(duì)研究草酸脫羧酶殺蟲作用分子機(jī)制及研發(fā)新型殺蟲劑提供了重要基礎(chǔ),為生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐.

    參考文獻(xiàn):

    [1]劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2002.

    [2]李明,雙寶,李海濤,等.枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,40(9):111114.

    [3]程洪斌,劉曉橋,陳紅漫.枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006,22(1):109112.

    [4]溫海燕.枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J].獸醫(yī)科技, 2012(3):118119.

    [5]曹茂新,洪楓,朱利民.草酸脫羧酶及其應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志, 2005 ,25(Z):170175.

    [6]LIU Y, CHEN Z, NG T B, et al. Bacisubin, an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B916[J]. Peptides, 2007,28(3):553559.

    [7]劉永鋒,陳志誼,周明國(guó),等. 枯草芽孢桿菌Bs916 的抑菌活性及其抑菌物質(zhì)初探[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007,9(1):92954.

    [8]于俊杰,陳志誼,胡建坤,等. 枯草芽孢桿菌Bs916 草酸脫羧酶基因Bacisubin 的克隆、原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的酶活性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012,28(3):497502.

    [9]李林珂,高玉千,崔錦,等. 一株蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006(3):5052.

    [10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社, 1999:370384.

    [11]BANERJEE A B, BOSE S K. Aminoacid configuration of mycobacillin[J]. Nature, 1963,200:471.

    [12]TAMEHIRO N , OKAMOTO Y, OKAMOTO S, et al. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Antimicrob agents chemother, 2002,46:315320.

    [13]沈錦玉,尹文林,曹錚,等.枯草芽孢桿菌B115抗菌蛋白的分離純化及部分性質(zhì)[J].水生生物學(xué)報(bào), 2005,29(6):689693.

    [14]白延琴,辛小玲, 來有志,等.枯草芽孢桿菌的分離篩選[J].畜牧獸醫(yī)雜志, 2013,32(2):2427,31.

    [15]BESSON F, MICHEL G. Isolation and characterization of new iturins: iturin D and iturin E[J]. J Antibiotics, 1987,40(4):437 442.

    [16]DELEU M, PAQUOT M, NY LANDER. Fengycin interaction with lipidmono layers at the air aqueous interface implications for the effect of fengycin on b iologicalm emb ranes[J]. Colloid Interface Sci, 2005,283(2):358365.

    [17]陳志誼,許志剛,陸凡,等. 拮抗細(xì)菌B916 培養(yǎng)液對(duì)水稻紋枯病菌的抗生活性及其抗菌物質(zhì)的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2000,16(3):148152.

    [18]羅楚平,陳志誼,劉永鋒,等. 生防菌Bs916 合成脂肽類化合物Bac 操縱子突變株構(gòu)建及功能[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2009,49(4):445452.

    (編輯王?。?

    摘要以從土壤中自行分離的219株芽胞桿菌中篩選的一株枯草芽胞桿菌菌株HX08為研究對(duì)象,通過菌落形態(tài)觀察、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡等進(jìn)行菌體形態(tài)觀察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鑒定,該株細(xì)菌屬枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis,命名為HX08,并將其16S rRNA基因序列提交上Genebank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得登陸號(hào)KF774302.通過生測(cè)發(fā)現(xiàn),HX08菌株在60 h發(fā)酵時(shí)間段對(duì)棉鈴蟲的致死效果最好.對(duì)該菌株發(fā)酵液提取的活性蛋白進(jìn)行初步研究,建立了HPLC技術(shù)分離體系,使用H2O做流動(dòng)相,以0.5 mL/min 流速洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)分別為215、254和280 nm,收集第15 mL收集管處即保留時(shí)間為31 min的2號(hào)峰粗分離物活性較高.切取SDSPAGE膠上相對(duì)應(yīng)活性峰目的蛋白質(zhì)條帶酶解,利用質(zhì)譜( LTQMS) 技術(shù)進(jìn)行了分子特性分析,鑒定發(fā)現(xiàn)殺蟲活性蛋白成分為草酸脫羧酶.

    關(guān)鍵詞枯草芽胞桿菌;菌株鑒定;生理生化特性;殺蟲活性

    中圖分類號(hào)S476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537(2014)05001407

    枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)具有典型的芽胞桿菌特征,是一類好氧、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌[1],作為一種有益的土壤細(xì)菌,對(duì)人畜相對(duì)安全,發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和抗逆生長(zhǎng)的孢子都讓其對(duì)多種病原菌產(chǎn)生拮抗作用[2].枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的分離純化及抗菌作用的分子機(jī)制、拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控等研究已經(jīng)積累了豐富的資料,所篩得的拮抗菌株數(shù)量也較多,但是應(yīng)用到殺蟲方面的菌株較少,潛力有待發(fā)掘[3].鑒于目前農(nóng)作物生產(chǎn)中存在的病蟲害防治問題,本研究從本地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),力求獲得適合本地區(qū)的對(duì)鱗翅目害蟲具有高效殺蟲活性的枯草芽胞桿菌,為開發(fā)該菌的生物防治功能和擴(kuò)大農(nóng)作物應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ).

    3討論

    根據(jù)該菌在平板上的菌落形態(tài),初步推斷為芽胞桿菌類,故采用高溫法篩選,優(yōu)化了菌株的分離過程,提高了分離效率.本研究通過一系列方法,對(duì)從湖南長(zhǎng)沙市采集到的土樣中利用高溫條件篩選到的219株芽胞桿菌中,分離得到一株新菌株并進(jìn)行了鑒定和歸類.將測(cè)得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜尋,該株菌與Bacillus subtilis strain CU12(JX489167.1)具有很高相似性,序列相似性為99%,可認(rèn)為屬于枯草芽胞桿菌中一個(gè)新的菌株(HX08).

    研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis在低pH環(huán)境下也可以誘導(dǎo)合成草酸脫羧酶[78],枯草芽胞桿菌生防菌株Bs916 可產(chǎn)生抗菌蛋白對(duì)核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum) 和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) 的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,隨后鑒定該蛋白為草酸脫羧酶[910].該酶單體結(jié)構(gòu)含有2個(gè)結(jié)構(gòu)相似的cupin結(jié)構(gòu)域, 并且在每個(gè)域的中心部位含有一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn), 和周圍的氨基酸殘基結(jié)合成為雙核中心, 另外它的N末端還含有短螺旋突出肽鏈[8],該酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在結(jié)構(gòu)域II的結(jié)合位點(diǎn)上[1116],本研究分離出的活性物質(zhì)的具體殺蟲機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究.HX08菌株60 h的發(fā)酵液殺蟲效果更為明顯,說明進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后菌株的殺蟲活性物質(zhì)仍然繼續(xù)增加,能提高殺蟲效果.鑒于目前市場(chǎng)很少有能有效防治鱗翅目害蟲的枯草芽胞桿菌微生物制劑[1718],本實(shí)驗(yàn)分離出對(duì)棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有致死毒力的殺蟲菌株,對(duì)研究草酸脫羧酶殺蟲作用分子機(jī)制及研發(fā)新型殺蟲劑提供了重要基礎(chǔ),為生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐.

    參考文獻(xiàn):

    [1]劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2002.

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    (編輯王健)

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