小型香豬復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的構(gòu)建及組織學(xué)特點*

陶 宇，伍津津，吳國選，魯元剛，朱堂友，畢建軍，雷 霞

組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)用以修復(fù)、維持、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。組織工程皮膚是組織工程中研究最早、進(jìn)展最快的領(lǐng)域，在短短的30年發(fā)展進(jìn)程中，已經(jīng)從開始的表皮片、真皮替代物，發(fā)展到具有雙層結(jié)構(gòu)的人工皮膚，較之原先簡單的封閉創(chuàng)面，恢復(fù)皮膚缺損區(qū)的屏障功能，已經(jīng)向主動促進(jìn)創(chuàng)面愈合乃至永久性覆蓋創(chuàng)面方面發(fā)展延伸，為解決大面積燒傷及其他臨床救治所需的皮源缺乏提供了治療手段［1］。國外已有多種商品化的皮膚替代物出售并用于基礎(chǔ)研究和臨床治療，如應(yīng)用于皮膚大面積燒傷、靜脈性潰瘍及大皰性皮膚病等皮膚損毀性疾病的治療［2-4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，主要由Eagle動物細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，Gibco公司）、羥基哌嗪乙磺酸（HEPES，Sigma 公司）、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Hyclone公司）、表皮生長因子（EGF，Sigma公司）和胰島素（Novo Nordisk A／s），按比例配制；殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、層黏蛋白（均為Sigma公司）；分離酶（Sigma公司）；胰島素（徐州萬邦生化制藥有限公司）；氫化可的松（中國上海信誼藥廠）；胰蛋白酶（Sigma公司）；表皮細(xì)胞生長因子（Sigma公司）；膠原酶（Sigma 公司）

1.1.2 設(shè)備 二氧化碳孵箱（TC2323，美國Sheld lab公司）、超凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、一次性培養(yǎng)瓶（Sigma），水純化系統(tǒng)（美國 Milli-Q Biocel Millipore Corporation）等。

1.2 方法

1.2.1 角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞制備 取筆者所在科已構(gòu)建的小型香豬細(xì)胞庫中的第3～12代角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，復(fù)蘇后接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，37℃孵箱中靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)90%融合后加入0.25%胰蛋白酶2 ml，室溫下消化2～5 min，光鏡下當(dāng)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大時，加入2 mlDMEM終止消化，1000 r／min離心，棄上清，培養(yǎng)液重懸，獲得角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes，KC）懸液和纖維細(xì)胞（fibroblasts，F(xiàn)B）懸液備用［5，6］。

1.2.2 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚制備 按筆者已建立的方法進(jìn)行［7］。即：小型香豬真皮替代物的培養(yǎng)，冰浴條件下依次加入一定量的濃縮Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、Ⅰ型膠原、殼多糖、糖胺聚糖等。每一步充分?jǐn)嚢杌靹?，? mol／L NaOH調(diào)整溶液pH 至7．2～7.4，然后加入豬的成纖維細(xì)胞懸液2 ml（細(xì)胞數(shù)約109／L）并混勻。將該混合物吸人110 mm培養(yǎng)皿中。室溫下靜置15 min左右形成凝膠，加入Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基10 ml。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0．05的CO2孵箱培養(yǎng)。換液1次／2～3 d。制備小型香豬組織工程皮膚：上述制備的人工真皮培養(yǎng)3 d后在其表面加入傳代培養(yǎng)的豬的角質(zhì)形成細(xì)胞懸液2 ml（細(xì)胞數(shù)約109／L）。改用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（含表皮細(xì)胞生長因子10 μg／L、胰島素 0．12 U ／ml、氫化可的松 0．5 g／L、青霉素 100 U／ml、鏈霉素 100 U／ml）培養(yǎng)，換液 1次／2～3 d。培養(yǎng)6 d左右將替代物置于設(shè)計好的鋼絲網(wǎng)上做氣-液界面培養(yǎng)。

1.2.3 組織學(xué)檢查 在培養(yǎng)15 d時，將復(fù)方殼多糖組織工程皮膚用中性甲醛溶液和2.5%戊二醛固定24 h以上，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋和切片，蘇木精—伊紅（HE）染色，在顯微鏡下測量表皮部分的厚度。

2 結(jié) 果

2．1 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)情況 復(fù)蘇后的小型香豬角質(zhì)形成細(xì)胞鏡下呈橢圓形或多角形，靜置培養(yǎng)4 h后見細(xì)胞貼壁生長，約5 d融合成片，鋪滿整個瓶底，呈“鋪路石樣”。可在體外連續(xù)傳代。

2．2 真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)情況 復(fù)蘇后的小型香豬成纖維細(xì)胞鏡下呈橢圓形或梭形，培養(yǎng)2 h后即見細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，約3～5 d基本融合，呈旋渦狀生長。

2.3 豬真皮基質(zhì)浸沒培養(yǎng)的變化情況 剛制備的真皮基質(zhì)呈紅色，倒置顯微鏡下凝膠各層面均可見尚未恢復(fù)形態(tài)的類圓形或不規(guī)則形的成纖維細(xì)胞，3 h或更長時間恢復(fù)梭形，但有分支。以后凝膠中的成纖維細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞狹長，一般有2個以上分支，排列沒有一定的方向性。3 d后隨著凝膠的收縮，人工真皮逐漸與培養(yǎng)板壁和底分離，漂浮于培養(yǎng)液中，面積縮小，厚度變薄，顏色逐漸變成乳白色，透光度下降，不易見到凝膠中的細(xì)胞。真皮基質(zhì)的收縮發(fā)生于第3天，開始并不同步，最大收縮發(fā)生于第6～12天，真皮基質(zhì)的直徑收縮到45%左右。以后收縮減慢，收縮度趨于一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，真皮替代物的大小差異變得不明顯。加入角質(zhì)形成細(xì)胞后，真皮基質(zhì)將加快收縮。

2．4 小型香豬組織工程皮膚的培養(yǎng)情況 在培養(yǎng)第3天的直徑約8 cm的真皮基質(zhì)上加入傳代后的小型香豬角質(zhì)形成細(xì)胞，其上可見覆蓋了一層菲薄的角質(zhì)形成細(xì)胞層。浸沒培養(yǎng)6 d后置400目篩網(wǎng)上做氣—液界面培養(yǎng)，角質(zhì)形成細(xì)胞層色素日漸加深。至直徑4 cm大小時基本停止收縮。氣液界面培養(yǎng)14 d后的組織工程皮膚有一定的彈性和韌性，有一定的抗拉力和抗擠壓力。

2．5 大體觀察 制備的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚質(zhì)地柔韌，富含液體，厚約 1．5～2．0 mm，表面的表皮層呈黑褐色，色澤均勻，與下方的真皮層結(jié)合緊密，在移動、剪切及縫合過程中不易發(fā)生表皮層剝離。組織工程皮膚有一定的抗張強度，適合臨床操作需要。

2.6 組織學(xué)檢查 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的光鏡觀察結(jié)果，鏡下表、真皮雙層結(jié)構(gòu)清晰可見（圖1）。表皮厚約150 μm，各層結(jié)構(gòu)分化良好，依次分為基底層、棘層和角質(zhì)層，共有7～12層細(xì)胞，最外層的角化表皮細(xì)胞呈松散的角蛋白絲，可分離。表皮下方處可見較多的表皮突伸向真皮空間，在真皮區(qū)形成圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，類似角化珠。真、表皮連接有起伏，真皮中可見較多呈梭形結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞，真皮支架結(jié)構(gòu)松散。與正常小型香豬皮膚（圖2）相比，體外構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層較薄，角質(zhì)形成細(xì)胞無角化，可見散在的空泡樣變性細(xì)胞，基底細(xì)胞較少，上皮角、真皮乳頭層不明顯，真皮網(wǎng)狀層較疏松，無毛細(xì)血管、汗腺、皮脂腺等正常皮膚結(jié)構(gòu)。

圖1 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚顯微鏡下結(jié)構(gòu)觀察

3 討 論

圖2 正常小型香豬皮膚的顯微鏡下結(jié)構(gòu)觀察

皮膚組織工程學(xué)是應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)的基本方法，將體外培養(yǎng)的高濃度組織細(xì)胞，擴增后吸附于一種生物相容性良好并可被人體逐步吸收的細(xì)胞外基質(zhì)上，進(jìn)行人工皮膚構(gòu)建和移植。皮膚的組織結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，分為表皮、真皮和皮下組織3部分。此外，還有血管、毛囊、汗腺、皮脂腺等。目前體外培養(yǎng)的具有全部上述結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚尚未問世。近年來組織工程皮膚的研究已經(jīng)取得了許多突破性進(jìn)展，并已在臨床應(yīng)用中取得了令人滿意的效果。目前，已有多個組織工程皮膚商品化，如Epicel、A11oDerm、Dermgraft、Apligraf、Pelanac、Integra 等，其中 Apligraf和Dermagraft均已通過嚴(yán)格的臨床試驗評價，用于燒傷和其他皮膚缺損性疾病的治療，并獲美國FDA批準(zhǔn)試用于臨床［8-10］。

本實驗采用組織工程的方法，在鼠尾膠原中加入殼多糖、糖胺聚糖等天然細(xì)胞外基質(zhì)及傳代培養(yǎng)的貴州小型香豬成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞，成功構(gòu)建了小型香豬的復(fù)合殼多糖組織工程皮膚。與正常小型香豬皮膚相比，體外構(gòu)建的組織工程皮膚組織學(xué)上還存在表皮層較薄，角質(zhì)形成細(xì)胞角化不明顯，基底細(xì)胞較少，上皮角、真皮乳頭層不明顯，真皮網(wǎng)狀層較疏松，無毛細(xì)血管、汗腺、皮脂腺等缺陷，需要進(jìn)一步更深入的研究。該種方法培養(yǎng)的人工皮膚屬于雙層活性皮膚替代物，在組織學(xué)上表皮、真皮雙層結(jié)構(gòu)清晰；表皮各層結(jié)構(gòu)分化良好，依次分為基底層、棘層和角質(zhì)層，表明其中的角質(zhì)形成細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有生長、分裂和分化活性。真皮中的成纖維細(xì)胞具有代謝活性，不僅使膠原凝膠收縮形成較緊密的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，而且還產(chǎn)生和分泌膠原及其他基質(zhì)成分至膠原網(wǎng)格中。本實驗成功培養(yǎng)出了小型香豬的活性皮膚替代物，并對具體的培養(yǎng)條件、技術(shù)方法、組織學(xué)特征進(jìn)行了分析比較，為組織工程皮膚替代物的制備及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］雷 霞，伍津津，朱堂友，等．復(fù)方殼多糖人工皮膚促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用［J］．中國臨床康復(fù)，2001，8（17）：3300-3302.

［2］朱堂友，伍津津，李文維．皮膚創(chuàng)面覆蓋物的研究進(jìn)展［J］．國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2000，26（1）：6-9.

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［5］吳國選，伍津津，朱堂友，等.豬復(fù)合人工皮膚組織工程學(xué)研究：小型香豬角質(zhì)形成細(xì)胞庫的構(gòu)建［J］．中國臨床康復(fù)，2004，8（32）：7142-4.

［6］吳國選，伍津津，朱堂友，等．貴州小型香豬皮膚成纖維細(xì)胞庫的構(gòu)建［J］．中國臨床康復(fù)，2004，8（29）：6386-8.

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