茄子遺傳轉(zhuǎn)化植株再生體系的優(yōu)化

張明華，陳鈺輝，劉富中，張映，連勇

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京，100091）

茄子（Solanum melongena L.）是世界各地廣泛栽培的重要蔬菜之一，營養(yǎng)價(jià)值豐富，為加快育種進(jìn)程，國內(nèi)外已先后從茄子的器官分化[1，2]、花藥培養(yǎng)[3]、胚狀體誘導(dǎo)[4～6]、原生質(zhì)體培養(yǎng)[7]、小孢子培養(yǎng)[8，9]子葉與下胚軸離體再生[10～12]等多方面進(jìn)行了研究。近30 a來，國內(nèi)的茄子組織培養(yǎng)研究工作取得了很大進(jìn)展，但是和同科同屬的番茄[13]、馬鈴薯[14]相比，仍有一定距離。茄子再生體系研究面臨的一個(gè)主要難題就是不定芽分化頻率較低，缺少通用穩(wěn)定的適于茄子遺傳轉(zhuǎn)化的植株再生體系。因此探索高效的受體再生途徑，建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系是目前的主要任務(wù)。本試驗(yàn)在課題組已有茄子離體培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上[15]，探討了不同外植體、激素配比、基因型等因素對(duì)茄子離體培養(yǎng)植株再生的影響。通過對(duì)植株再生體系的優(yōu)化，以期得到普遍適用的茄子離體培養(yǎng)再生體系，提高茄子遺傳轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)基因工程在茄子改良育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茄子品種為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的高代自交系長茄03154、03204，圓茄07683、07675。以種子露白后苗齡10 d的茄子下胚軸、子葉作為外植體。

1.2 無菌苗培養(yǎng)及外植體接種

將茄子種子用75%酒精浸泡30 s，后用無菌水沖洗1次，再用10%NaClO溶液浸泡20 min后用無菌水沖洗3次。接種至附加0.7%瓊脂和2%蔗糖的1/2 MS 培養(yǎng)基上，置于（25±1）°C、光照時(shí)間為16 h/d、光強(qiáng)2000～3000 Lx光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。種子露白后苗齡10 d的無菌苗2片子葉可完全展開時(shí)從瓶中取出無菌苗，無菌條件下，將下胚軸切成 0.8～1.0 cm小段、子葉切成（3～5）mm×5 mm小塊。將子葉正面向上放置，下胚軸橫向放置，接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，相同光照培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。每個(gè)品種、每種處理接種3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種8～10個(gè)外植體，重復(fù)3次。2周繼代1次，4周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

①誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置ZT、6-BA、IAA3種激素不同種類及不同濃度組合，共12個(gè)組合處理，詳見表1。

②植株再生培養(yǎng)基優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基，外源激素ZT設(shè) 0.2、0.5、0.8mg/L3個(gè)濃度處理。

③再生植株生根培養(yǎng)基優(yōu)化 以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，外源激素 NAA 設(shè) 0.10、0.30、0.5mg/L3個(gè)濃度處理。

所有處理培養(yǎng)基均附加有機(jī)成分Morel維生素 1000倍液 2mL/L、蔗糖 3%、瓊脂 8.0%，pH值5.8，121℃溫度下高壓滅菌 15 min。

1.4 不定芽生長和生根統(tǒng)計(jì)

待愈傷組織生長出不定芽后，轉(zhuǎn)移至植株再生培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5個(gè)三角瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)不定芽生長情況。當(dāng)不定芽長出2～4片真葉、長2～3 cm時(shí)，將其自基部切下并轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種10個(gè)三角瓶，每瓶接種2個(gè)再生苗，重復(fù)3次，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

由表2可知，不同配比的12種培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)品種的子葉和下胚軸均能誘導(dǎo)出不定芽，但其誘導(dǎo)率存在顯著差異。在不使用6-BA的培養(yǎng)基M1～M6中，ZT 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L組合的M4培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的效果最好。為了研究比較6-BA與ZT對(duì)外植體不定芽誘導(dǎo)分化的效果，生長素IAA取最佳濃度 0.2mg/L，分裂素ZT、6-BA取不同濃度進(jìn)行比較。當(dāng)只加入6-BA時(shí)，M9培養(yǎng)基下胚軸的平均誘導(dǎo)率高于M7和M8培養(yǎng)基；當(dāng)ZT和6-BA組合加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，M10培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好，且誘導(dǎo)率明顯高于M4和M9。

表1 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同激素濃度組合

表2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合誘導(dǎo)4種茄子品種不同外植體的不定芽誘導(dǎo)率 %

圖1 4個(gè)品種的下胚軸（A）和子葉（B）外植體在M1～M12培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率

圖2 下胚軸（A）和子葉（B）外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的2周后的生長情況

由DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可知，不同激素濃度組合的培養(yǎng)基顯著地影響了茄子不定芽的誘導(dǎo)率，4個(gè)品種之間表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律（圖1）。2.0mg/L ZT 和3.0mg/L 6-BA 均能較好地誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，0.2mg/L的IAA可以最佳地促進(jìn)分裂素ZT和6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)分化。6-BA、ZT對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化效果與茄子外植體類型和基因型都相關(guān)。對(duì)于不同外植體，ZT對(duì)子葉的誘導(dǎo)效果高于6-BA，最佳濃度為2.0mg/L；6-BA對(duì)下胚軸的誘導(dǎo)效果較好，最佳濃度為3.0mg/L。對(duì)于不同基因型，不定芽誘導(dǎo)的最適分裂素不同，6-BA對(duì)圓茄07675和長茄 03204的誘導(dǎo)效果高于 ZT，ZT對(duì)07683和03154誘導(dǎo)效果較好。IAA濃度為0.2mg/L，ZT 1.0～2.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L 組合使用時(shí)對(duì)4個(gè)品種的不定芽誘導(dǎo)效果均較好，據(jù)此推測，該水平下的ZT+6-BA+IAA組合可以比較廣泛地適用于不同茄子品種的不定芽誘導(dǎo)分化。

2.2 外植體取材部位對(duì)植株再生的影響

橫向放置在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的下胚軸，培養(yǎng)1周后形態(tài)學(xué)頂端向上翹起，2周后開始有叢生芽在翹起的頂端形成，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接形成微型的小簇叢生芽結(jié)構(gòu)，同時(shí)接觸到培養(yǎng)基的下胚軸形態(tài)學(xué)下端形成愈傷組織（圖2A）。在下胚軸形態(tài)學(xué)頂端沒有形成叢生芽或叢生芽生長緩慢的情況下，下端愈傷組織也可分化產(chǎn)生不定芽。平鋪在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的子葉，1周后體積明顯膨大，傷口處開始產(chǎn)生愈傷組織，2周左右生長出不定芽生長點(diǎn)（圖2B）。

表3 茄子愈傷組織誘導(dǎo)類型及其形態(tài)特征的比較

圖3 愈傷組織類型分類

表4 不同外植體愈傷誘導(dǎo)類型和不定芽誘導(dǎo)率

試驗(yàn)中茄子的子葉和下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率都在80%以上，子葉出愈率相對(duì)稍高。外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織大致可以分為C1、C2、C33種類型（表3）。C1型愈傷組織疏松，多呈透明淡黃色（圖3A），分裂旺盛，較難誘導(dǎo)分化出不定芽；C2型愈傷組織較C1型緊密，多呈淺綠色（圖3B），分化成不定芽系數(shù)較高；C3型愈傷組織緊實(shí)，多呈綠褐色（圖3C），誘導(dǎo)分化產(chǎn)生少量不定芽。試驗(yàn)可觀察到不同愈傷組織類型與不定芽的分化存在一定的制約關(guān)系，C2型最為理想，C1型和C3型愈傷組織產(chǎn)生不定芽的誘導(dǎo)率較低。但不同類型愈傷組織之間可以通過調(diào)節(jié)激素濃度在愈傷形成早期實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換。若愈傷組織生長過于旺盛，則應(yīng)降低生長素濃度，提高分裂素濃度；若愈傷組織生長緩慢，過于緊實(shí)，或色澤暗淡，趨于褐化，則要提高生長素濃度，減少分裂素濃度。同時(shí)還應(yīng)注意保證培養(yǎng)基的養(yǎng)分充足，及時(shí)繼代。

在各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，子葉和下胚軸誘導(dǎo)出的主要愈傷組織類型不同，芽分化率也有顯著差異（表4）。由子葉得到的大多為C2型愈傷組織，部分為C1型以及少量C3型愈傷組織；下胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織大多為C3型。下胚軸的誘導(dǎo)率平均為59.0%，最高達(dá)79.3%；子葉的誘導(dǎo)率平均為29.8%，最高為53.9%。4個(gè)品種下胚軸外植體的誘導(dǎo)率都顯著高于子葉，表明下胚軸外植體比子葉更容易誘導(dǎo)出芽，下胚軸分化能力高于子葉。

2.3 基因型對(duì)植株再生的影響分化能力影響的比較

4個(gè)品種的分化能力有明顯差異，且在分化能力較低的子葉外植體上差異更為顯著。圓茄07683最容易誘導(dǎo)分化出不定芽，其次是長茄03204和圓茄07675，長茄03154再生能力最差。4個(gè)品種不同外植體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同。就下胚軸來說，長茄03154和圓茄07675的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是M10，長茄03204和圓茄07683的為M11。從子葉來說，03154和07683的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是M11，03204和07675的為M10。

2.4 不同ZT濃度對(duì)不定芽生長的影響

下胚軸和子葉誘導(dǎo)出的不定芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長緩慢，培養(yǎng)基中的IAA和高濃度的ZT或6-BA會(huì)抑制不定芽的生長，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至植株再生培養(yǎng)基中，下胚軸及子葉愈傷組織在植株再生分化培養(yǎng)基上2周后的生長情況見圖4。由表5可知，下胚軸產(chǎn)生的不定芽在ZT濃度為0.5～0.8mg/L時(shí)，伸長率都為100%，但當(dāng)ZT濃度為0.8mg/L時(shí)，不定芽畸形率較大。子葉產(chǎn)生的不定芽的畸形率隨著ZT濃度的增加也在不斷升高。當(dāng)ZT濃度為0.5mg/L 時(shí)，伸長率最高，達(dá) 93.0%，且得到的有效再生苗數(shù)最多。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳植株再生培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5mg/L。

圖4 下胚軸和子葉愈傷組織接種于植株再生分化培養(yǎng)基上2周后的生長情況

2.5 不同生根培養(yǎng)基對(duì)再生苗生根的影響

將再生苗接種在生根培養(yǎng)基上1周后切口處出現(xiàn)膨大，并形成少量的愈傷組織，2周左右出現(xiàn)不定根（圖5A）。如表6所示，不加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)茄子再生苗的生根效果較好，主根數(shù)最多（圖5B），添加 0.1mg/L NAA 誘導(dǎo)不定芽生根效果最好，根系粗壯，更適合移栽（圖5C）。隨著NAA濃度的升高，基部開始產(chǎn)生較大的白色或淡黃色愈傷組織，有效生根減少。本試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1mg/L。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了4個(gè)茄子品種的子葉和下胚軸組織培養(yǎng)和植株再生問題，建立了一套適于茄子遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化組織培養(yǎng)與再生體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素組合的培養(yǎng)基、不同外植體類型和不同茄子基因型均顯著影響茄子不定芽的分化效果。2.0mg/L ZT和3.0mg/L 6-BA 能分別較好地誘導(dǎo)子葉和下胚軸產(chǎn)生不定芽，ZT 1.0～2.0mg/L+6-BA 1.0～2.0mg/L 組合比較廣泛地適用于不同茄子品種的不定芽誘導(dǎo)分化，0.2mg/L的 IAA 可以最佳地促進(jìn)分裂素ZT和6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)分化；茄子下胚軸的再生能力要顯著高于子葉；不同茄子品種間的分化能力差異明顯。最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.2mg/L，下胚軸的誘導(dǎo)率可提高至79.3%，子葉的誘導(dǎo)率可提高至53.9%；最佳植株再生培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5mg/L；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1mg/L。

下胚軸形態(tài)學(xué)下端和子葉產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽多為單生芽，但子葉產(chǎn)生的不定芽易出現(xiàn)玻璃化和畸形苗現(xiàn)象。下胚軸形態(tài)學(xué)頂端產(chǎn)生的成簇叢生芽一般只有1～2株能夠生長發(fā)育成完整植株。利用下胚軸的極性現(xiàn)象，正向扦插比橫向放置可以縮短頂端產(chǎn)生叢生芽的分化時(shí)間，這與黃志銀等[16]的研究結(jié)果相似。下胚軸近根部片段比近子葉片段的形態(tài)發(fā)生潛能大，更易誘導(dǎo)分化出叢生芽。這與國外Matsuok等[4]、Sharma等[17]的研究結(jié)果相同，他們認(rèn)為下胚軸的不同部位形態(tài)建成的潛能有明顯不同，可產(chǎn)生的不定芽數(shù)目從高到低依次是基部、亞基部、亞頂端、頂端。然而余瀾波等[10]得到相反的結(jié)果，他們認(rèn)為下胚軸的上端比下端容易誘導(dǎo)出芽，且在極性上端易誘導(dǎo)出芽，下端易誘導(dǎo)出根，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

表5 不同ZT濃度對(duì)不定芽生長的影響

表6 不同培養(yǎng)基配方的生根效果比較

圖5 再生苗的生根情況

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