轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因和Bar基因雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的研究

賈小霞，齊恩芳，王一航，文國(guó)宏，龔成文，王紅梅，李建武，馬勝，胡新元*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅含有大量淀粉和優(yōu)質(zhì)蛋白，而且含有多種維生素和礦物質(zhì)，是宜糧、宜菜、宜飼、宜做工業(yè)原料等用途廣泛的塊莖類作物，其塊莖形成與膨大期需要大量的水分供應(yīng)。近年來，我國(guó)大部分地區(qū)持續(xù)干旱，特別是在北方地區(qū)，干旱發(fā)生頻率較高［1-2］。干旱脅迫是限制馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，嚴(yán)重影響著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，培育綜合性狀優(yōu)良的抗旱品種非常迫切。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的工具，在不改變作物原有特性的基礎(chǔ)上，將控制重要農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因?qū)肫渲?，從而?shí)現(xiàn)品種改良的目的。

目前，馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化中，絕大多數(shù)用Ca MV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，Ca MV35S啟動(dòng)子是植物組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，它驅(qū)動(dòng)外源基因在植物的各種組織和所有發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)［3-5］，這不僅增加植株的代謝負(fù)擔(dān)、浪費(fèi)大量的物質(zhì)和能量，還改變植物的基因調(diào)控和代謝途徑，導(dǎo)致植物的形態(tài)發(fā)生改變，從而影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。另一方面，植物的耐旱性是一個(gè)復(fù)雜的多基因控制系統(tǒng)［6］，通過轉(zhuǎn)入單個(gè)功能基因改良的方式，作用單一，很難奏效［7-8］。

rd29A是DREBlS調(diào)控的目的基因，在植物細(xì)胞缺水時(shí)能夠大量表達(dá)。rd29A的啟動(dòng)子區(qū)域含有ABRE（ABA-responsive element，保守序列：CACGTGGC／ACACGTGGC）順式作用元件和DRE核心序列。植物細(xì)胞缺水時(shí)，植物產(chǎn)生的內(nèi)源ABA通過信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生與rd29A啟動(dòng)子的ABRE序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，可以啟動(dòng)rd29A的表達(dá)，DREB1S轉(zhuǎn)錄因子與rd29A啟動(dòng)子DRE核心序列結(jié)合也可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。在植物細(xì)胞不缺水時(shí)，rd29A并不表達(dá)［9-11］，它是一個(gè)干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

干旱響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一系列耐旱相關(guān)基因的表達(dá)，證明是一種更加有效地提高耐旱性的途徑［12-17］。目前研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子DREB1A可以調(diào)控40多個(gè)與干旱、高鹽和低溫脅迫有關(guān)的功能基因的表達(dá)［18-21］。因此，以rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DREB1A轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，可以大大減小因基因組成型表達(dá)（如植物基因工程中常用的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)）給轉(zhuǎn)基因植株帶來的不利影響，并避免轉(zhuǎn)入單個(gè)功能基因作用單一的局限性，提高植物抗逆性更有優(yōu)勢(shì)。本研究從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆了rd29A啟動(dòng)子和DREB1A轉(zhuǎn)錄因子，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因和Ca MV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Bar基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)馬鈴薯進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為改良馬鈴薯種質(zhì)資源和薯類作物的抗逆性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：擬南芥為Columbia生態(tài)型，2010年10月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所培養(yǎng)獲得試管苗。馬鈴薯隴薯10號(hào)為2011年4月在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源和生物技術(shù)研究室脫毒擴(kuò)繁的試管苗。整個(gè)試驗(yàn)完成時(shí)間為2010年10月到2013年8月。菌株和質(zhì)粒：載體p GEM-T vector和大腸桿菌菌株DH5a購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，其余菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、氨卞青霉素、卡拉霉素、IPTG、X-gal等試劑均購(gòu)自Ta KaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；其他各種試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?；驕y(cè)序由賽百盛公司完成。

1.2 擬南芥總基因組DNA的提取和DREB1A基因及rd29A啟動(dòng)子的克隆

分別根據(jù)GenBank中檢索到的擬南芥DREB1A基因序列（genebank ID：AB007787），rd29A啟動(dòng)子原序列（genebank ID：D13044），利用PCR技術(shù)從擬南芥基因組中分離DREB1A基因和rd29A啟動(dòng)子。通過分子生物學(xué)分析軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)合成了以下4條引物（北京賽百盛生物技術(shù)公司），DREB1A基因引物，D1：5′GCG GGA TCCBamHⅠATG AAC TCA TTT TCT GCT TTT TC 3′；D2：5′GCG ACT AGTSpeⅠTTA ATA ACT CCA TAA CGA TAC 3′。rd29A啟動(dòng)子引物，R1：5′GCG AAG CTTHindⅢAGT ACTScaⅠAAC GCA TGA TTT GAT GGA GGA 3′，R2：5′GCG GGA TCCBamHⅠCTT TCC AAT AGA AGT AAT CAA ACC 3′。

1.3 NOS終止子序列NOS1和NOS2的亞克隆

根據(jù)NOS終止子序列，通過分子生物學(xué)分析軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)合成了以下4條引物（北京賽百盛生物技術(shù)公司），NOS1序列引物，N1：5′GCG GGA TCCBamHⅠGAA TTT CCC CGA TCG T 3′，N2：5′GCG GAG CTCSacⅠACT AGTSpeⅠGAA TTC CCG ATC TAG TAA CA 3′；NOS2序列引物，N3：5′GCG GAA TTCEcoRⅠAAG CTTHindⅢGAA TTT CCC CGA TCG T 3′，N4：5′GCG CAC AAA GTGDraⅢGAA TTC CCG ATC TAG TAA CA 3′。

1.4 中間載體pBI121-rd29A-DR的構(gòu)建

用SacⅠ和Bam HⅠ酶切植物表達(dá)載體pBI121，回收大片段，將回收的大片段與NOS1序列連接，構(gòu)建成中間載體p BI121-N1，再用SpeⅠ和Bam HⅠ雙酶切p BI121-N1，回收大片段，將回收的大片段與基因DREB1A片段相連接，構(gòu)建成中間載體pBI121-DR，用Hin dⅢ和Bam HⅠ雙酶切pBI121-DR，回收大片段，將回收的大片段與rd29A啟動(dòng)子片段相連接，構(gòu)建成中間載體pBI121-rd29A-DR。

1.5 雙價(jià)植物表達(dá)載體p BI121-rd29-BDR的構(gòu)建

用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切植物表達(dá)載體p BI121，回收大片段，將回收的大片段與用同樣酶切p AHC25回收的小片段連接，構(gòu)建成中間載體p BI121-35S-Bar（圖1）。用Eco RⅠ和DraⅢ雙酶切pBI121-35S-Bar，回收大片段，將回收的大片段與NOS2序列連接，構(gòu)建成中間載體p BI121-35S-N2，用Hin dⅢ單酶切p BI121-35S-N2，回收酶切的小片段35S-Bar-Nos，并與用同樣酶切pBI121-rd29A-DR所得的載體大片段相連接，構(gòu)建成雙價(jià)植物表達(dá)載體p BI121-rd29-BDR。

1.6 馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化及其分子檢測(cè)

1.6.1 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 載體p BI121-rd29-BDR向根癌農(nóng)桿菌LBA4404的直接轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［22-23］。采用液氮凍融法將pBI121-rd29-BDR質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有50 mg／L利福平（rif-ampicin，Rif）、50 mg／L鏈霉素（streptomycin，Str）和50 mg／L卡那霉素（kanamycin，Kan）的固體 YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，獲得可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的工程農(nóng)桿菌LBA4404（p BI121-rd29-BDR）。

圖1 pBI121-rd29A-BDR載體Fig.1 Structure of vector p BI121-rd29A-BDR

1.6.2 馬鈴薯外植體的轉(zhuǎn)化及植株再生 將無菌試管苗切成0.5 cm長(zhǎng)，不帶腋芽的莖段，在固體培養(yǎng)基（MS＋2 mg／L 6-BA＋0.1 mg／L NAA＋2 mg／L GA3＋0.5 mg／L 2，4-D）制成的平板上預(yù)培養(yǎng)3 d，隨后在制備好的農(nóng)桿菌工程菌中浸泡8 min，其間不斷搖動(dòng)，取出后用無菌濾紙吸干表面的菌液，轉(zhuǎn)入附加羧卞青霉素（carbenicillin，Crb）500 mg／L的固體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于28℃黑暗共培養(yǎng)3 d。暗培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段轉(zhuǎn)移到附加草丁膦（phosphinothricin，PPT）2 mg／L和Crb 500 mg／L的相同培養(yǎng)基上，經(jīng)過抗性愈傷的初步篩選后轉(zhuǎn)接到抗性芽分化篩選培養(yǎng)基進(jìn)行抗性芽的誘導(dǎo)和篩選，連續(xù)光照強(qiáng)度2000 lx、（25±1）℃條件下誘導(dǎo)芽分化。至抗性芽長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入附加PPT 2 mg／L和Crb濃度逐漸減量的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)一步進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的抗性篩選和誘導(dǎo)生根。

1.6.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè) 參照楊錦芬等［24］的方法，用十六烷基三乙基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株及未轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的葉片總DNA。即在2 m L離心管中，加入500μL的2×CTAB和20μLβ-巰基乙醇，65℃預(yù)熱，取待檢測(cè)試管苗植株葉片0.5 g，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到預(yù)熱的離心管中，混勻后置65℃水浴中保溫30 min，并不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管，加等體積的氯仿／異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下12000 r／min離心10 min，移上清至另一離心管中，向管中加入1／100體積的RNase A溶液，37℃放置20～30 min，加入2倍體積的無水乙醇，會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，－20℃放置30 min后，12000 r／min離心10 min回收DNA沉淀，用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于適量的滅菌dd H2O中，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。以此DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.6.4 RT－PCR檢測(cè) 參照鄭琳琳等［25］的方法，用30%PEG模擬干旱條件，對(duì)馬鈴薯脅迫3 d后分析目的基因的表達(dá)情況。馬鈴薯總RNA的提取使用RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）試劑盒。cDNA的合成采用First strand cDNA Synthesis Kit（THERMO）試劑盒。以馬鈴薯actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，其特異引物為A1：5′GGA GAA AAT CTG GCA TCA TAC AT 3′，A2：5′GTT GGA AGG TAC TTA AAG AAG CC 3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為803 bp。RT－PCR 反應(yīng)體系25μL：包括10×buffer 2.5μL，Taq DNA 聚合酶0.5μL （5 U／μL），20 mmol／L上游引物1μL，20 mmol／L下游引物1μL，2.5 mmol／L d NTP 2μL，cDNA 0.5μL，dd H2O 補(bǔ)至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：96℃預(yù)變性5 min后，95℃1 min，53℃1 min、72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 DREB1A基因和rd29A啟動(dòng)子的克隆

以擬南芥總基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物D1、D2），用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1條約700 bp的條帶（圖2），其大小與基因DREB1A的大小相符。將PCR產(chǎn)物連接到p GEM-T easy載體上，然后導(dǎo)入大腸桿菌篩選出陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列比較，結(jié)果其同源性達(dá)99.69%。

利用PCR克隆技術(shù)在擬南芥總基因組中分離rd29A啟動(dòng)子，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1條約1000 bp的特異性條帶（圖3），回收特異片段并連接到p GEM-T easy中，然后導(dǎo)入大腸桿菌篩選出陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的rd29A序列比較，結(jié)果其同源性達(dá)到99.47%。整個(gè)序列與原序列有個(gè)別堿基不同，其余完全吻合，并且其作為啟動(dòng)子的各個(gè)功能原件齊全。

2.2 中間載體pBI121-rd29A-DR的構(gòu)建

2.2.1 載體p BI121-N1的構(gòu)建及檢測(cè) 用SacⅠ和Bam HⅠ酶切植物表達(dá)載體p BI121，回收大片段，將回收的大片段與NOS1序列按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，并將重組子分別用Hin dⅢ／SpeⅠ，Hin dⅢ／SmaⅠ雙酶切，分別得到了約1200和900 bp的片段（圖4），與預(yù)期片段相符，表明pBI121-N1成功構(gòu)建。

2.2.2 載體p BI121-DR的構(gòu)建及檢測(cè) 用SpeⅠ和Bam HⅠ雙酶切p BI121-N1，回收大片段，將回收的大片段與DREB1A基因片段按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，將重組子用Bam HⅠ／SpeⅠ雙酶切，以p BI121-DR質(zhì)粒DNA為模板，以D1、D2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，都得到了約700 bp的片段（圖5），與預(yù)期片段相符，表明pBI121-DR成功構(gòu)建。

圖3 rd29A啟動(dòng)子的PCR結(jié)果Fig.3 Promoter rd29A fragment amplified by primers R1，R2M：D2000標(biāo)記D2000 marker；1，2：以R1、R2為引物擴(kuò)增的rd29A啟動(dòng)子片段Fragment amplified from the template of rd29A by primers R1 and R2.

2.2.3 載體p BI121-rd29A-DR的構(gòu)建及檢測(cè) 用Hin dⅢ和Bam HⅠ雙酶切載體p BI121-DR，回收大片段，將回收的大片段與rd29A啟動(dòng)子按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，將重組子分別用Bam HⅠ／SpeⅠ、Hin dⅢ／Bam HⅠ雙酶切，并以p BI121-rd29A-DR質(zhì)粒DNA為模板，以D1、D2，R1、R2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，都分別得到了約700和1000 bp的片段（圖6）。

2.3 雙價(jià)植物表達(dá)載體p BI121-rd29-BDR的構(gòu)建

2.3.1 載體p BI121-35S-Bar的構(gòu)建及檢測(cè) 用Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切植物表達(dá)載體p BI121，回收大片段，將回收的大片段與用同樣酶切p AHC25回收的小片段按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，分別用Hin dⅢ／Eco RⅠ，Hin dⅢ／Bam HⅠ雙酶切，分別得到了約1800和900 bp的片段，與預(yù)期片段相符（圖7），表明p BI121-35S-Bar成功構(gòu)建。

2.3.2 載體p BI121-35S-N2的構(gòu)建及檢測(cè) 用Eco RⅠ和DraⅢ雙酶切p BI121-35S-Bar，回收大片段，將回收的大片段與NOS2序列按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，并將重組子用Hin dⅢ單酶切，得到了約1700 bp片段（圖8），與預(yù)期片段相符，表明pBI121-35S-N2成功構(gòu)建。

2.3.3 植物表達(dá)載體p BI121-rd29-BDR的構(gòu)建及檢測(cè) 用Hin dⅢ單酶切p BI121-35S-N2，回收小片段35SBar-Nos，并與用同樣酶切p BI121-rd29A-DR所得的載體大片段按1∶4混合，加入10 U的T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，并將重組子用Hin dⅢ單切，得到了約1700 bp片段（圖9），與預(yù)期片段相符，表明pBI121-rd29-BDR成功構(gòu)建。

2.4 馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生

經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的馬鈴薯莖段通過共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和生根培養(yǎng)后，PPT篩選到無菌抗性苗22株，抗性苗誘導(dǎo)過程見圖10。

圖6 載體p BI121-rd29-DR鑒定結(jié)果Fig.6 Restriction analysis and PCR detection of pBI121-rd29-DR M：MarkerⅢ標(biāo)記 MarkerⅢ；1，2：分別為Bam HⅠ／SpeⅠ，Hin dⅢ／Bam HⅠ雙酶切pBI121-rd29-DR質(zhì)粒產(chǎn)物Digested result of pBI121-rd29-DR respectively by Bam HⅠ／SpeⅠand Hin dⅢ／Bam HⅠ；3，4：以pBI121-rd29-BDR質(zhì)粒DNA為模板，分別以D1／D2，R1／R2為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物Fragment amplified from the template of pBI121-rd29-BDR respectively by primers D1／D2 and R1／R2.

圖8 載體pBI121-35S-N2鑒定結(jié)果Fig.8 Restriction analysis of p BI121-35S-N2M：MarkerⅢ標(biāo)記MarkerⅢ；1：Hin dⅢ單酶切pBI121-35S-N2質(zhì)粒的結(jié)果Digested result of p BI121-35S-N2 by Hin dⅢ.

圖9 載體pBI121-rd29-BDR鑒定結(jié)果Fig.9 Restriction analysis of p BI121-rd29-BDRM：MarkerⅢ標(biāo)記MarkerⅢ；1：Hin dⅢ單酶切pBI121-rd29-BDR質(zhì)粒的結(jié)果Digested result of pBI121-rd29-BDR by Hin dⅢ.

圖10 抗性苗誘導(dǎo)過程Fig.10 Induction of resistant seedlingsA：共培養(yǎng)3 d的馬鈴薯莖段Potato stems after 3 d from coculturing with Agrobacterium；B：含PPT 2 mg／L篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織Resistant embryogenic calli cultured on selected medium supplemented with 2 mg／L PPT；C：含PPT 2 mg／L篩選培養(yǎng)基上的抗性苗Resistant seedlings regenerated on selected medium supplemented with 2 mg／L PPT；D：含PPT 2 mg／L生根培養(yǎng)基上的抗性苗Resistant plant on root medium with 2 mg／L PPT.

2.5 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的PCR檢測(cè)

以轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因的特異引物為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒p BI121-rd29-BDR）和18株抗性苗擴(kuò)增出約700 bp的片段，而空白對(duì)照、陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)化馬鈴薯）和部分轉(zhuǎn)化植株無擴(kuò)增條帶（圖11為部分轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)結(jié)果）。圖11可以看出，以轉(zhuǎn)化植株4，5，6和8號(hào)的基因組DNA為模板擴(kuò)增出了目的基因條帶，而7號(hào)沒有目的條帶出現(xiàn)，說明4，5，6和8號(hào)植株的基因組中有DREB1A基因的整合，為轉(zhuǎn)基因植株，而7號(hào)沒有目的基因的整合，為非轉(zhuǎn)基因植株。

2.6 RT-PCR 檢測(cè)

對(duì)部分PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行RT－PCR分析，以未轉(zhuǎn)化的隴薯10號(hào)馬鈴薯為對(duì)照，以馬鈴薯actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)在30%PEG脅迫3 d后，DREB1A基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況（圖12所示為部分結(jié)果），圖12可以看出基因DREB1A在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩胁]有表達(dá)。進(jìn)一步說明DREB1A基因已經(jīng)整合到隴薯10號(hào)馬鈴薯基因組中并能夠在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

3 討論

植物的耐旱性是復(fù)雜的生理適應(yīng)，它不是單一基因控制的，通過單基因改良的方式很難奏效［7-8］，與以往轉(zhuǎn)單個(gè)抗旱基因的思路不同，本研究從與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子DREB1A入手構(gòu)建植物表達(dá)載體。

目的基因表達(dá)的時(shí)間、空間和強(qiáng)度，在很大程度上是由啟動(dòng)子決定的［26-28］。目前，馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化中，絕大多數(shù)用Ca MV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)［26-27］，但大部分結(jié)果并不盡如人意。本研究用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A取代Ca MV35S組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，將會(huì)使外源基因在植物細(xì)胞缺水時(shí)大量表達(dá)，細(xì)胞不缺水時(shí)并不表達(dá)，這樣既可以滿足植物分子育種的需要，又可以減少Ca MV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在所有組織和所有發(fā)育階段表達(dá)造成的植株代謝負(fù)擔(dān)，避免物質(zhì)和能量的巨大浪費(fèi)。

圖11 以D1／D2為引物的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的PCR檢測(cè)Fig.11 PCR detection of potato transformantM：D 2000標(biāo)記 MarkerⅢ；1：空白對(duì)照Amplified by D1／D2 of H 2 O；2：陰性對(duì)照 Potato non-transformant；3：陽(yáng)性對(duì)照（pBI121-rd29-BDR）Positive control（p BI121-rd29-BDR）；4～8：轉(zhuǎn)化植株以 D1／D2 為引物擴(kuò)增結(jié)果 Amplified by D1／D2 of potato transformant.

圖12 轉(zhuǎn)DREB1A基因植株的RT-PCR檢測(cè)Fig.12 RT-PCR detection of potato transformant1：非轉(zhuǎn)基因植株Non-transgenic plant；2～4：轉(zhuǎn)基因植株Transgenic plants.

以往植物基因轉(zhuǎn)化中一般采用抗生素作為篩選標(biāo)記系統(tǒng)［26-29］。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)抗生素的解毒作用導(dǎo)致的交叉保護(hù)，高頻率的未轉(zhuǎn)化植株和嵌合體也通過了抗生素篩選，細(xì)胞產(chǎn)生的假轉(zhuǎn)化體多，無疑增加了工作量。本研究以Bar基因替換了抗生素抗性基因，不但克服了抗生素篩選的局限性，而且使轉(zhuǎn)基因馬鈴薯獲得了對(duì)除草劑的抗性，使用與抗除草劑基因相配的除草劑，能有效除去雜草，不僅有望解決大田的草荒問題，也可節(jié)省大量勞動(dòng)力。

從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析來看，本研究克隆的rd29A啟動(dòng)子各個(gè)功能原件齊全，DREB1A基因與已注冊(cè)的序列（genebank ID：AB007787）基本一致，構(gòu)建的雙價(jià)植物表達(dá)載體p BI121-rd29-BDR理論上符合基因表達(dá)的要求，可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)DREB1A基因在植物中的誘導(dǎo)型表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究中，除草劑PPT篩選到了農(nóng)藝性狀良好的轉(zhuǎn)基因植株，PCR和RT-PCR檢測(cè)證明DREB1A基因已整合到隴薯10號(hào)馬鈴薯基因組中，并在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有望提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗旱性。目前，作者正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗旱性分析研究。