腎上腺素對抗雙黃連中藥注射劑所致心律失常

劉 磊，李雪華，王 偉，羅卓卡，陳可塑，王中越，陳 龍，

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)科技部規(guī)范化中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046;2.常州市第四人民醫(yī)院，江蘇常州213032;3.南京大學(xué)金陵學(xué)院，江蘇南京 210089;4.泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇泰州 225300)

雙黃連中藥注射劑(Shuang－h(huán)uang－lian Injection，SHL)由金銀花、黃芩、連翹組成，臨床上用于病毒及細(xì)菌感染引起的上呼吸道感染，肺炎，扁桃體炎及咽炎等。臨床廣泛使用后，其不良反應(yīng)報(bào)道也逐年增加，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡［1］?；谄洳涣挤磻?yīng)機(jī)制為過敏反應(yīng)的理論［2－4］，臨床上常使用抗過敏反應(yīng)的藥物搶救雙黃連中藥注射液出現(xiàn)的致命性不良反應(yīng)，如β腎上腺素受體激動劑(腎上腺素)，糖皮質(zhì)激素和 H1受體拮抗劑(異丙嗪)［5－6］。然而，近年來的臨床［7－8］及基礎(chǔ)研究報(bào)道［9－10］，雙黃連中藥注射劑能夠?qū)е戮徛孕穆墒С！Ｍ瑫r(shí)有研究表明，H1受體拮抗劑異丙嗪加重雙黃連的心律失常，應(yīng)禁止使用異丙嗪［11－12］。本研究用實(shí)驗(yàn)證明腎上腺素具有對抗雙黃連的致心律失常作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

注射用SHL(凍干)(規(guī)格:每支600 mg，批號:1210019，哈藥集團(tuán)中藥二廠提供)，鹽酸腎上腺素(規(guī)格:每支1 g·L－1，批號:120507，上海禾豐制藥有限公司提供)。RM－6240D型四道生理記錄儀，SWF－2W型微電極放大器(成都儀器廠);膜片鉗放大器(Axon instruments 200B，USA);數(shù)字－信號轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A美國Axon公司)。

1.2 動物

豚鼠體質(zhì)量250～300 g，雌雄不拘。由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2012－0008;實(shí)驗(yàn)動物使用許可證:SYXK(蘇)2011－0053。

1.3 注射用雙黃連和腎上腺素劑量及濃度的計(jì)算

(1)在體實(shí)驗(yàn)劑量的換算:人體與動物用量的轉(zhuǎn)化是按體表面積系數(shù)計(jì)算，按每公斤體質(zhì)量進(jìn)行比較，豚鼠為人的4.6倍［13］。臨床上SHL用量為60 mg·kg－1，換算到豚鼠為 276 mg·kg－1(1 倍臨床劑量)，10倍臨床劑量為2760 mg·kg－1;臨床上腎上腺素(鹽酸鹽)成人極量為皮下注射1 mg，按照正常成人體質(zhì)量為60 kg計(jì)算，成人最大劑量為0.017 mg·kg－1，換算到豚鼠為 0.078 mg·kg－1(1倍臨床劑量)。

(2)離體實(shí)驗(yàn)濃度的換算:人的細(xì)胞外液大約為 200 mL·kg－1(約為20%)，臨床上 SHL用量為60 mg·kg－1，換 算 到 臨 床 上 血 液 的 濃 度 為0.3 g·L－1，因此，實(shí)驗(yàn)的組織和細(xì)胞灌流液1 倍臨床SHL濃度為0.3 g·L－1。臨床上腎上腺素(鹽酸鹽)成人極量為皮下注射1 mg，按照正常成人體質(zhì)量為60kg計(jì)算，人的細(xì)胞外液大約為200 mL·kg－1(約為 20%)，1 倍臨床腎上腺素(鹽酸鹽)的濃度為0.083 mg·L－1。

1.4 在體實(shí)驗(yàn)

豚鼠ip給予20%烏拉坦(5 mL·kg－1)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，分離出頸外靜脈，針形電極引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計(jì)算機(jī)。

首先，將溶于生理鹽水的SHL在5 min內(nèi)以276 mg·kg－1(1 倍臨床劑量)→2760 mg·kg－1(10倍臨床劑量)的順序進(jìn)行累計(jì)靜脈緩慢推注，注射后穩(wěn)定5 min。出現(xiàn)緩慢性心律失常后，順序給予溶于生理鹽水的腎上腺素0.0078 mg·kg－1(1/10臨床劑量)和 0.039 mg·kg－1(1/2臨床劑量)。于靜脈推腎上腺素5 min后記錄心電圖，分析心率(HR)、P－R 間 期、QTc 間 期。QTc=QT ×(1000)1/3/RR1/3(單位為 ms)［14］。

1.5 離體實(shí)驗(yàn)

1.5.1 離體心電圖記錄

豚鼠ip給予20%烏拉坦(5 mg·kg－1)麻醉，開胸取心，置于0～4℃的無鈣灌流液中使之停搏，修剪分離主動脈，行主動脈插管后，結(jié)扎固定。采用Langendorf裝置，在37℃恒溫、充氧(95%O2+5%CO2)條件下，灌流液持續(xù)進(jìn)行逆向灌流，調(diào)整流速約為4 mL·min－1，使心臟復(fù)跳。同時(shí)將3個電極分別置于心尖、右心室游離壁，主動脈根部，引導(dǎo)離體心臟的心電圖，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計(jì)算機(jī)。

首先按順序灌流SHL 0.3 g·L－1(1倍臨床濃度)→1.5 g·L－1(5 倍臨床濃度)，誘發(fā)緩慢性心律失常后，再灌流 SHL 1.5 g·L－1+ 腎上腺素0.42 mg·L－1(5 倍 臨 床 濃 度)，最 后 用 SHL 1.5 g·L－1和灌流液依次洗脫。上一濃度灌流結(jié)束后隨后灌流下一濃度，每一組灌流持續(xù)5 min，分別記錄各濃度組給藥5 min后的心電圖。分析HR，P－R，QRS和QTc間期。

心臟灌流液成分如下(mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES 20，葡萄糖11，用 NaOH調(diào)pH 至7.3。

1.5.2 單個心室肌細(xì)胞的分離

按改良的酶解法分離豚鼠單個左心室肌細(xì)胞。動物麻醉及離體心臟灌流同上，經(jīng)主動脈用含95%O2及5%CO2灌流液逆行灌流。用無鈣灌流液(37℃)沖洗并使心臟停跳。用含膠原酶Ⅰ型及胰蛋白酶(2及0.1 g·L－1)的無鈣灌流液反復(fù)灌流5～8 min，至心臟膨大、松弛。取下心臟，將左心室肌組織塊置于盛有無鈣灌流液中充分剪碎，用直徑200 μm 的尼龍網(wǎng)過濾，逐步加鈣至2 mmol·L－1，置于室溫下備用。灌流液的組成為(mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，MgCl21.7，HEPES 20，葡萄糖 20，?；撬?10。用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3。

1.5.3 動作電位的記錄

采用膜片鉗全細(xì)胞電流鉗法，在室溫(20～22℃)下進(jìn)行。用細(xì)胞外液灌流，其組成為 (mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，NaHCO34.4，MgCl21.7，CaCl21.8，HEPES 20，葡萄糖20，?；撬?0(NaOH調(diào)至pH 7.3)。充灌內(nèi)液的電極入水阻抗約為 2 ～5 MΩ，電極內(nèi)液為 (mmol·L－1):KCl 135，EGTA 10，HEPES 10，葡萄糖5，K2ATP 3，Tris－GTP 0.5(KOH 調(diào)至 pH 7.1)。在電流鉗模式下，調(diào)節(jié)電流刺激強(qiáng)度，使用能產(chǎn)生完好動作電位的最小電流刺激強(qiáng)度(通常為2～5 nA，100～200 ms)，信號的發(fā)放和采集均由pClamp 9.0軟件完成，并將數(shù)據(jù)存儲于硬盤內(nèi)。依次灌流SHL 0.3 g·L－1→1.5 g·L－1→3 g·L－1→SHL 3 g·L－1+ 腎上腺素0.83 mg·L－1(10 倍臨床濃度)，分別記錄各濃度組給藥5 min后的動作電位。分析動作電位復(fù)極于50%及90%水平的時(shí)程(APD50及APD90)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎上腺素對雙黃連誘發(fā)的豚鼠在體心律失常的影響

圖1和表1的結(jié)果顯示，SHL 2760 mg·kg－1(10倍臨床劑量)能明顯降低豚鼠HR，延長P－R和QRS 間 期 (P＜0.05)。 而 給 予 腎 上 腺 素0.0078 mg·kg－1(1/10 臨床劑量)和0.039 mg·kg－1(1/2臨床劑量)則分別不同程度地提高了 SHL 2760 mg·kg－1臨床劑量所致的緩慢心率，同時(shí)，明顯改善 SHL 2760 mg·kg－1臨床劑量引起的 P－R，QRS間期的延長(P＜0.05)。

Fig.1 Representative traces of ECG before and after administration of Shuanghuanglian Injection(SHL)alone or SHL combined with adrenaline(Adr)in guinea pigs.A:before adminstration;B:SHL 276 mg·kg －1;C:SHL 2760 mg·kg －1;D:SHL 2760 mg·kg －1+Adr 0.0078 mg·kg －1;E:SHL 2760 mg·kg －1+Adr 0.039 mg·kg －1.

Tab.1 Effects of SHL alone and SHL plus Adr on heart rate(HR)，P－R，QRS and QTc intervals in anesthetized guinea pig hearts in vivo

2.2 腎上腺素對雙黃連誘發(fā)的豚鼠離體心律失常的影響

圖2和表2的結(jié)果顯示，SHL 1.5 g·L－1(5 倍臨床劑量)能明顯減慢 HR(P ＜0.05)。SHL 1.5 g·L－1(5倍臨床劑量)+腎上腺素0.42 mg·L－1(5倍臨床劑量)能明顯加快SHL 1.5 g·L－1所致的緩慢心率(P ＜0.05)，同時(shí)明顯縮短 QTc(P ＜0.05)。SHL 1.5 g·L－1(5倍臨床劑量)進(jìn)行洗脫，可明顯減慢心率，并延長QTc(P＜0.05)。最后用灌流液進(jìn)行洗脫，各參數(shù)基本能恢復(fù)至給藥前的水平。

Fig.2 Representative traces of ECG before and after perfusion of SHL alone or combined with Adr in isolated guinea pig hearts.A:before drug perfusion;B:after SHL 0.3 g·L －1perfusion;C:after SHL 1.5 g·L －1perfusion;D:after SHL 1.5 g·L －1+Adr 0.42 mg·L －1perfusion;E:after SHL 1.5 g·L－1 washout;F:after washout.

Tab.2 Effect of SHL alone or SHL combined with Adr on HR，P－R，QRS and QTc intervals in isolated guinea pig hearts

2.3 腎上腺素對SHL作用的豚鼠心肌細(xì)胞動作電位的影響

表3及圖3顯示，SHL 3 g·L－1(10倍臨床劑量)顯著延長電位復(fù)極于50%及90%水平的時(shí)程(APD50及 APD90)(P ＜ 0.05)，SHL 3 g·L－1(10倍臨床濃度)+腎上腺素0.83 mg·L－1(10倍臨床濃度)明顯縮短已延長的APD50或APD90(P＜0.05)，接近于正常對照水平。

Tab.3 Effect of SHL alone or SHL combined with Adr on action potential durations at 50%(APD50)or APD90in cardiomyocytes from guinea pig hearts

Fig.3 Representative traces of action potentials before and after perfusion of SHL alone or combined with Adr from cardiomyocytes of left ventricles of guinea pigs.

3 討論

本研究結(jié)果表明，在體豚鼠心電圖實(shí)驗(yàn)顯示，SHL 10倍臨床劑量(2760 mg·kg－1)能明顯減慢豚鼠心率，延長P－R，QRS間期;1/10倍臨床劑量的腎上腺素(0.0078 mg·kg－1)和1/2倍臨床劑量的腎上腺素(0.039 mg·kg－1)能不同程度地對抗SHL的上述作用。離體豚鼠心電圖實(shí)驗(yàn)顯示，5倍臨床濃度SHL 1.5 g·L－1顯著減慢豚鼠心率并延長P－R 間期，5 倍臨床濃度腎上腺素(0.42 mg·L－1)明顯對抗SHL的上述作用，并能縮短QRS間期。豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位實(shí)驗(yàn)表明，10倍臨床濃度SHL(3 g·L－1)顯著延長 APD50及 APD90，而 10 倍臨床濃度腎上腺素(0.83 mg·L－1)明顯縮短APD50及APD90，對抗雙黃連的延長作用。

本課題組前期研究也表明，SHL能通過抑制hNav1.5，L 型 Ca2+及 hERG 電流［10］降低豚鼠心率，延長P－R、QRS和QTc間期。而腎上腺素能增加 Na+［15］、L 型 Ca2+［16］、Ikr［17－18］及 Iks［19－20］電流，縮短豚鼠心肌細(xì)胞的動作電位時(shí)程，能有效地對抗SHL引起的緩慢性心律失常。

因此，臨床上當(dāng)SHL引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)又無法判斷其發(fā)生機(jī)制時(shí)，應(yīng)采用腎上腺素?fù)尵龋瓤梢詫蛊淇赡艿倪^敏反應(yīng)，又可以對抗其可能的緩慢性心律失常。

［1］Wang DC，Zhang L，Li AZ.Document analysis of 39 death cases induced by traditional Chinese medicine injection［J］.Chin J Pharmacoepidemiol(藥物流行病學(xué)雜志)，2004，13(2):77－80.

［2］Zhang LP.Analysis of adverse reactions of TCM injections［J］.Chin J Clin Rational Drug Use(臨床合理用藥)，2011，4(10A):83－84.

［3］Chen Y.Analysis of adverse reactions of TCM injections and their rational use［J］.China Mod Doctor(中國現(xiàn)代醫(yī)生)，2011，49(1):6－7.

［4］Li TQ.Avoiding adverse drug reactions to Chinese medicine injections［J］.Chin J Evid-based Med(中國循證醫(yī)學(xué)雜志)，2010，10(2):111－115.

［5］Zhang SQ.Analysis of clinical applications of SHL injection［J］.J Changchun Univ Tradit Chin Med(長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2012，28(1):127－128.

［6］Wang LN.Analysis of 66 cases of allergic shock caused by Shuanghuanglian injection［J］.Eval Anal Drug-Use Hosp China(中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析)，2010，10(4):368－370.

［7］Du DC，Shen AZ，Jiang L.Analysis of adverse reaction time of traditional Chinese medicine injection［J］.Chin Hosp Pharm J(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2011，31(10):864－866.

［8］Tang CY，Zeng LW，Lin H，Qin ZB.Analysis on ADR/ADE reports induced by Shuanghuanglian injection in Guangxi of 2009［J］.China Pharm(中國藥房)，2010，21(16):1501－1504.

［9］Shi Z，Xu Y，Zhou SY，Peng GP，Chen L.Electrophysiological effects of Shuang－h(huán)uang－lian intravenous injection on guinea pig hearts［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2010，24(6):455－459.

［10］Chen L，Titch T，Luo Z，Xu Y，Li X，Huang F，et al.Confirmation of a proarrhythmic risk underlying the clinical use of common Chinese herbal intravenous injections［J］.J Ethnopharmacol，2012，142(3):829－835.

［11］Li XH， Luo ZK， Liu L， Sheng XB，Wang ZY，Chen L.Promethazine aggravates arrhythmia induced by Qing－kai－ling injection［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2013，27(4):691－697.

［12］Luo ZK， Li XH， Liu L， Sheng XB，Wang ZY，Chen L.Promethazineaggravatesproarrhythmia effect induced by Chinese herbal intravenous injection of Shuanghuanglian［J］.Chin J New Drugs Clin Rem(中國新藥與臨床雜志)，2013，32(3):217－221.

［13］Reagan－Shaw S，Nihal M，Ahmad N.Dose translation from animal to human studies revisited［J］.FASEB J，2008，22(3):659－661.

［14］Li J，Qu LH，Jiang HL，Kiorpes A，Xu J.Anesthetic guinea pig model for QT interval prolongation evaluation［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2010，24(2):146－149.

［15］Wang HW，Yang ZF，Zhang Y，Yang JM，Liu YM，Li CZ.Beta－receptor activation increases sodium current in guinea pig heart［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(8):1115－1122.

［16］Skeberdis VA，Jurevicius J，F(xiàn)ischmeister AR.Beta－2 adrenergic activation of L－type Ca2+current in cardiac myocytes［J］.J Pharmacol Exp Ther，1997，283(2):452－461.

［17］Heath BM，Terrar DA.Protein kinase C enhances the rapidly activating delayed rectifier potassium current，IKr，through a reduction in C－type inactivation in guinea－pig ventricular myocytes［J］.J Physiol，2000，522(Pt 3):391－402.

［18］Harmati G，Bányász T，Bárándi L，Szentandrássy N，Horváth B，Szabó G，et al.Effects of β－adrenoceptor stimulation on delayed rectifier K+currents in canine ventricular cardiomyocytes［J］.Br J Pharmacol，2011，162(4):890－896.

［19］Szentandrássy N，F(xiàn)arkas V，Bárándi L，Hegyi B，Ruzsnavszky F，Horváth B，et al.Role of action potential configuration and the contribution of Ca2+and K+currents to isoprenaline－induced changes in canine ventricular cells ［J］. Br J Pharmacol，2012，167(3):599－611.

［20］Stengl M，Volders PG，Thomsen MB，Sp?tjens RL，Sipido KR，Vos MA.Accumulation of slowly activating delayed rectifier potassium current(IKs)in canine ventricular myocytes［J］.J Physiol，2003，551(Pt 3):777－786.