電針豐隆穴對(duì)高脂血癥大鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)的影響

王瓊,田佳玉,肖穎,張紅星

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,武漢 430022)

高脂血癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂而形成的血漿脂質(zhì)中一種或多種成分的濃度超過(guò)正常高限的一種病癥。它是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化癥的主要危險(xiǎn)因素,與高血壓、冠心病、腦血管疾病等密切相關(guān)。近年來(lái),隨著高脂血癥發(fā)病率的升高,動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性也相應(yīng)增加。因此,有必要積極預(yù)防和及時(shí)控制血脂水平[1]。臨床上,藥物性降脂治療較為常用且效果肯定,但降脂藥物對(duì)肝腎功能有損害,因此有其局限性[2]。大量報(bào)道均已證實(shí)[3-5],針灸療法以方法多、操作簡(jiǎn)易、無(wú)毒副反應(yīng)等特點(diǎn),已應(yīng)用于高脂血癥的臨床治療,且取得一定成效[6-8]。本研究通過(guò)觀(guān)察電針高脂血癥大鼠的豐隆穴,對(duì)其腹腔巨噬細(xì)胞表面抗原CD11b、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響,明確電針在治療高脂血癥中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠40只,雄性,體重180～200 g,由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為[SCXK(鄂)2008-0004]。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照組、高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組,每組8只大鼠。

1.2 主要藥品與儀器

流式細(xì)胞儀(美國(guó)ABI公司),抗大鼠CD11b-PERCP單克隆抗體(美國(guó)eBioscience公司),抗大鼠ICAM-1-FITC單克隆抗體(美國(guó)eBioscience公司),1640培養(yǎng)液,PBS緩沖液(美國(guó) HyClone公司),Ionomycin,莫能霉素(美國(guó) ENZO公司),PMA,多聚甲醛(美國(guó) SIGMA公司),皂苷(美國(guó) Amresco公司),0.1%BSA(瑞士 Roche公司),LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華威有限公司),0.25 mm×25 mm不銹鋼針灸針。

1.3 動(dòng)物造模

正常對(duì)照組大鼠用普通大鼠飼料自然喂養(yǎng),高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組大鼠用高脂飼料[9](豬油 10%,蛋黃粉5%,膽固醇1%,丙基硫氧嘧啶0.2%,脫氧膽酸鈉0.5%,蔗糖 5%,基礎(chǔ)飼料 78.3%)喂養(yǎng),其中高脂＋普通飼料組及高脂＋普通飼料治療組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)28 d后,換用普通飼料,同時(shí)對(duì)高脂飼料治療組及高脂＋普通飼料治療組大鼠進(jìn)行電針豐隆穴治療。

1.4 治療方法

取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10],選取雙側(cè)豐隆穴,模擬人體經(jīng)穴定位。豐隆穴在大鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)后三里下1 mm,腓骨小頭下約5 mm處。用0.25 mm×25 mm針灸針,對(duì)豐隆穴直刺 7 mm,快速捻轉(zhuǎn)至針下有沉澀感后,接韓式穴位神經(jīng)刺激儀,等幅疏密波,頻率為2/100 Hz,電流強(qiáng)度2 mA,以動(dòng)物肢體微顫為度,每次治療時(shí)間為30 min,每天1次,連續(xù)治療28 d。常規(guī)溫度、濕度及統(tǒng)一飲水喂養(yǎng)。

1.5 血脂的檢測(cè)

所有SD大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈用肝素鈉試管采血4～5 mL,上、下緩慢顛倒3次混勻。4℃離心(3000 r/min)10 min,取上層血清2 mL,置入EP管中,﹣20℃冰箱保存。送至我院檢驗(yàn)科,根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū),采用Olympus AU2700型全自動(dòng)生化分析儀,檢測(cè)血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面抗原 CD11b、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)的分子表達(dá)水平。

1.6.1 提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞

參照蘭青等[11]的方法來(lái)提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,具體步驟如下。引頸殺死大鼠,手提尾鼠將全鼠浸入70%乙醇中浸泡5 min后,再將大鼠倒立提起,從腹腔一側(cè)近腹股溝處注入1640培養(yǎng)液30～50 mL,仰臥平放并用手指輕柔大鼠腹部3 min,靜置5 min后,在超凈工作臺(tái)上打開(kāi)大鼠腹腔,觀(guān)察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時(shí),用無(wú)菌滴管吸取腹腔液約 10 mL,1200 r/min離心8 min。去上清,留下離心管底部乳白色沉淀,1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。

1.6.2 固定及染色

將分離后的巨噬細(xì)胞液加至96孔U型板,0.2 mL 1×107/mL,加入PMA(5 ng/mL)、ionomycin (500 ng/mL)和莫能霉素(Monensin)(終濃度為2 μM)置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞,PBS洗1次,調(diào)整細(xì)胞濃度1×107/mL,50 μL細(xì)胞加入抗 CD11b抗體,4℃孵育30 min,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定4℃,30 min。PBS洗2次,第2次用含0.1%的皂苷,0.1%BSA的PBS洗細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度 1×107/mL,50 μL細(xì)胞加入 ICAM-1抗體,4℃孵育 30 min, PBS洗 2次,PBS重懸細(xì)胞至0.3 mL,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6.3 設(shè)置流式檢測(cè)對(duì)照

①空白孔 2×105/0.3mL細(xì)胞;②2×105/0.3mL細(xì)胞加CD11b抗體;③2×105/0.3mL細(xì)胞加ICAM-1抗體;④2×105/0.3mL細(xì)胞加CD11b抗體＋I(xiàn)CAM-1二標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,繼以 LSD檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,CD11b與ICAM-1相關(guān)性使用相關(guān)性分析,以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,一致性檢驗(yàn)采用Bland-A ltman分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 電針豐隆穴對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

由表1可以看出,與正常對(duì)照組相比,高脂飼料組大鼠血漿 TC、LDL-C明顯上升(P＜0.01),而 TG和HDL-C變化不明顯(P＞0.05);高脂＋普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組比較明顯下降(P＜0.01),較正常對(duì)照組仍明顯升高(P＜0.01);高脂飼料治療組與高脂飼料組比較,TC和LDL-C明顯下降(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組大鼠TC、LDL-C與高脂＋普通飼料組比較,明顯降低(P＜0.01),TG和HDL-C變化不明顯(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血脂變化 (±s,mmol/L)

表1 各組大鼠血脂變化 (±s,mmol/L)

注:與正常對(duì)照組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與高脂飼料組比較3)P＜0.01;與高脂＋普通飼料組比較4)P＜0.01

組別 n TC TG HDL-C LDL-C正常對(duì)照組 8 1.60±0.37 0.58±0.21 0.67±0.08 0.21±0.07高脂飼料組 8 10.91±3.012) 0.51±0.11 0.81±0.21 5.43±1.012)高脂飼料治療組 8 5.16±0.822)3) 0.57±0.16 0.61±0.18 1.29±0.311)3)高脂＋普通飼料組 8 6.79±1.052)3) 0.67±0.19 0.62±0.14 2.31±0.652)3)高脂＋普通飼料治療組 8 3.16±0.473)4) 0.52±0.17 0.72±0.18 0.69±0.453)4)

2.2 電針豐隆對(duì)高脂血癥大鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1的影響

由表 2可以看出,高脂飼料組大鼠巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)率較正常對(duì)照組明顯上升(P＜0.01),高脂＋普通飼料組大鼠巨噬細(xì)胞 CD11b、ICAM-1表達(dá)率較高脂飼料組明顯下降(P＜0.05),較正常對(duì)照組仍明顯上升(P＜0.01),高脂飼料治療組與高脂飼料組比較,CD11b、ICAM-1表達(dá)率明顯下降(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組與高脂＋普通飼料組比較,CD11b、ICAM-1表達(dá)率明顯降低(P＜0.01),高脂＋普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較,CD11b、ICAM-1表達(dá)率明顯降低(P＜0.01)。

表2 各組大鼠巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)率的變化(±s)

表2 各組大鼠巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)率的變化(±s)

注:與正常對(duì)照組比較 1)P＜0.05,2)P＜0.01;與高脂飼料組比較 3)P＜0.05,4)P＜0.01;與高脂＋普通飼料組比較5)P＜0.05,6)P＜0.01

組別 n CD11b(%)ICAM-1(%)正常對(duì)照組 8 16.29±1.73 2.04±0.63高脂飼料組 8 65.14±3.742) 18.21±2.442)高脂＋普通飼料組 8 48.73±2.272)3) 11.99±1.262)3)高脂飼料治療組 8 36.91±2.542)4)6) 5.80±1.244)6)高脂＋普通飼料治療組 8 26.49±2.121)4)6) 3.93±0.351)6)

2.3 CD11b與ICAM-1相關(guān)性分析

直線(xiàn)相關(guān)分析結(jié)果表明,CD11b與ICAM-1水平呈顯著正相關(guān)(r=0.947,P＜0.01)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 CD11b表達(dá)與ICAM-1表達(dá)的關(guān)系

3 討論

高脂血癥在中醫(yī)學(xué)典籍中并無(wú)相關(guān)記載,《內(nèi)經(jīng)》對(duì)膏脂的正常功能及代謝異常均有描述:“五谷之津液,和合而為膏者,內(nèi)滲于骨空,補(bǔ)益腦髓,而下流于陰股?！薄案吡恢?足生大丁?！苯陙?lái),眾多醫(yī)家將其歸于“痰證”、“瘀證”范圍。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,高脂血癥的產(chǎn)生與肝、脾、腎三臟關(guān)系最為密切,其病機(jī)為飲食肥甘厚味,損傷脾胃,同時(shí)肝膽疏泄功能不暢,不能泌輸精液而引起脾之消谷、運(yùn)化功能失調(diào),轉(zhuǎn)化為痰濁;或腎之陰陽(yáng)俱虛,相火妄動(dòng),致肝陽(yáng)上亢,甚則化火,木旺則乘土,使脾胃輸布功能失調(diào),濕熱郁結(jié),痰濁、瘀血內(nèi)生而阻塞血脈。其治療以化痰降濁、活血化瘀治其標(biāo),健脾益氣,強(qiáng)本清源治其本。

豐隆穴是足陽(yáng)明胃經(jīng)之絡(luò)穴,通脾胃二經(jīng),既可健胃,又可運(yùn)脾,在調(diào)理脾胃功能、調(diào)節(jié)血脂方面具有顯著的療效,具有祛痰、和胃降逆和健脾益胃的作用,《玉龍歌》載“痰多宜向豐隆尋”,為化痰首選穴。中醫(yī)學(xué)的“痰”與自由基代謝異常有關(guān),現(xiàn)代研究顯示[13],豐隆穴的化痰作用不僅與調(diào)節(jié)血脂有關(guān),而且能改善機(jī)體的自由基代謝。

膽固醇由食物及體內(nèi)生物所合成,對(duì)機(jī)體組織來(lái)說(shuō),維持膽固醇的供給,確保其代謝平衡是及其重要的。若機(jī)體總膽固醇太高,超過(guò)所合成和生物膜、膽汁酸及類(lèi)固醇激素等物質(zhì)的需要時(shí),膽固醇則會(huì)沉積于動(dòng)脈內(nèi)皮下的巨噬細(xì)胞中,引起內(nèi)皮下變形,從而致使血小板在動(dòng)脈內(nèi)壁集聚。如果同時(shí)還伴動(dòng)脈壁損傷及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,則會(huì)在動(dòng)脈內(nèi)膜形成脂斑,從而導(dǎo)致動(dòng)脈管腔變窄,引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。血中膽固醇主要由LDL-C攜帶運(yùn)輸,通過(guò)細(xì)胞膜上LDL-C的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇過(guò)高時(shí),可抑制LDL-C受體的補(bǔ)充,從而減少由血中攝取的膽固醇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針豐隆穴治療高脂血癥大鼠后,大鼠血漿中TC、LDL-C明顯降低。說(shuō)明了針刺豐隆穴降脂的效果是十分顯著的,從而能起到一定的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用。此外,高脂＋普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C較高脂飼料組明顯降低,說(shuō)明了控制高脂飲食對(duì)高脂血癥的轉(zhuǎn)歸具有良性作用。

高脂血癥不僅是動(dòng)脈粥樣硬化的促發(fā)因素,而且貫穿其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程當(dāng)中,和內(nèi)皮功能改變、白細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子改變等相互交織,相互影響,相互作用[14]。外周血單核細(xì)胞遷入動(dòng)脈內(nèi)皮下間隙,分化成巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的最早事件,這一事件的發(fā)生至少需要兩個(gè)條件,即單核細(xì)胞的活化和黏附分子的參與。整合素家族的CD1lb是黏附家族的重要成員之一,在白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞中起突出作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí),活化粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的 CD1lb表達(dá)量顯著增加,CDllb在白細(xì)胞表面的表達(dá)已成為白細(xì)胞活化的標(biāo)志[15]。ICAM-l為CD11b的配體,ICAM-1基因啟動(dòng)子上有1個(gè)基本的NF-κB位點(diǎn),VCAM-1基因有2個(gè)NF-κB位點(diǎn)。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能與白細(xì)胞表面的配體相應(yīng)地結(jié)合,介導(dǎo)白細(xì)胞的貼壁黏附,致白細(xì)胞聚集、浸潤(rùn),從而導(dǎo)致局部炎癥的發(fā)生[16]。黏附分子CD11b與ICAM-1的表達(dá)影響著中性粒細(xì)胞的跨內(nèi)皮移行作用,且這兩種分子有協(xié)同作用。兩者同樣在白細(xì)胞的黏附及遷移中扮演著重要的角色。NF-κB活化后能調(diào)控一系列基因的表達(dá),如黏附分子家族的細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等,研究表明[17],ADP激活的血小板能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌MCP-1,促進(jìn)其表面表達(dá) ICAM-1,NF-κB的激活是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高脂飼料組大鼠巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)率較正常對(duì)照組明顯上升,表明高脂血癥大鼠模型成功,大鼠處于炎癥狀態(tài)。高脂＋普通飼料組大鼠巨噬細(xì)胞CD11b、ICAM-1表達(dá)率較高脂飼料組明顯下降,較正常組仍明顯上升,說(shuō)明合理的飲食對(duì)控制高脂血癥有一定療效,但療效有限[18],仍需結(jié)合針灸進(jìn)行治療。高脂＋普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較,CD11b、ICAM-1表達(dá)率明顯降低;直線(xiàn)相關(guān)分析結(jié)果顯示,CD11b與 ICAM-1水平呈顯著正相關(guān),表明CD11b與ICAM-1在抑制炎癥反應(yīng)方面有一定的協(xié)同作用,這與Zhang等[19]研究是相符的。此外,電針豐隆穴能夠改善高脂血癥引起的炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能由于電針豐隆穴下調(diào)CD11b及黏附分子ICAM-1高表達(dá),抑制NF-κB的激活,從而阻斷NF-κB調(diào)控的炎癥反應(yīng),改善其介導(dǎo)的微循環(huán)障礙,減輕機(jī)體組織的損傷。然而,這一過(guò)程涉及到的機(jī)制是十分復(fù)雜的,未來(lái)對(duì)此還需要更深一步的研究探索。

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