異丹葉大黃素下調膀胱癌細胞中細胞周期蛋白D1表達的分子機制研究*

方 勇， 王章桂， 侯 琦， 盧 瑜

(1浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內科，浙江杭州310016;2中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所，北京100050;3南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院，浙江杭州310007)

從多種中藥成份中提取出的寡聚二苯乙烯類化合物(oligostilbenes)具有多種生物學活性，尤其是抗腫瘤活性正引起眾多研究者的關注［3-4］。我們的前期研究證實，從植物買麻藤中提取分離的中藥單體成分異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)可有效抑制膀胱癌細胞的增殖，并可下調細胞周期蛋白D1的表達水平，誘導G0/G1細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞遷移［5］。鑒于ISO下調細胞周期蛋白D1表達水平的分子機制尚不明確，本研究進一步深入地研究其分子機制，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 材料

ISO由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所侯琦教授提供，分子量為258 D［5］。ISO被溶解在DMSO，儲存終濃度為10 mmol/L。并進一步用DMSO稀釋，最后DMSO終濃度為0.1%(V/V)進行細胞培養(yǎng)實驗。相同濃度的DMSO(0.1%，V/V)被用來作為陰性對照。

抗細胞周期蛋白D1和Sp1(specificity protein 1)抗體購自Santa Cruz?？筩-Jun和GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)抗體均購自 Cell Signaling。新生牛血清和DMEM購自Gibco。DMSO購自Sigma。ATP生物發(fā)光檢測試劑盒購自 Promega。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記的細胞周期蛋白D1表達構建載體來自美國紐約大學醫(yī)學院Huang Chuanshu實驗室［6］。具體為:真核表達載體pEGFP-C3經EcoR I和BamH I雙酶切。根據GenBank中人cyclin D1 cDNA序列設計合成以下引物:上游引物5’-GCGAATTCCCATGGAACACCAGCTCCTG-3’，下 游 引物 5’-GCGGATCCTCAGATGTCCACGTCCCGCA-3’。反應條件為95℃預變性90 s，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共 35個循環(huán)。EcoR I和BamH I雙酶切后，以瓊脂糖膠回收試劑盒回收酶切產物。以T4連接酶連接pEGFP-C3和上述回收片段。轉化感受態(tài)大腸桿菌，隨機挑選菌落，并經測序鑒定。

細胞周期蛋白D1啟動子驅動的螢光素酶報告基因質粒載體來自Anil K.Rustgi博士(美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院腸胃科)［7］。人源性細胞周期蛋白D1野生型和-163位點突變型螢光素酶報告基因質粒載體(WT-cyclin D1-Luc和Sp1mut cyclin D1-Luc)來自Richard G.Pestell博士(美國托馬斯·杰斐遜大學 Kimmel癌癥中心)［8］。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和基因轉染 RT4和RT112膀胱癌細胞均購自ATCC。UMUC3細胞來自美國紐約大學醫(yī)學院 Huang Chuanshu教授處。RT4、RT112和UMUC3膀胱癌細胞分別在 RPMI-1640、Eagle′s MEM和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基中均含有100 mL/L新生牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

基因轉染步驟參照LipofectamineTM試劑盒說明書進行，分別在轉染后24、48和72 h于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP熒光。轉染72 h后，加入嘌呤霉素(puromycin)篩選4周，終濃度5 mg/L?？寺〖毎纬珊?，隨機挑選克隆，擴增抗性細胞，熒光顯微鏡觀察細胞內GFP表達熒光。

2.2 膀胱癌細胞中細胞周期蛋白D1的蛋白水平表達檢測 采用Western blotting法檢測膀胱癌細胞株細胞周期蛋白D1的蛋白水平表達。按照常規(guī)進行蛋白質的提取、定量和分離［5，9］。轉膜后先后與10 g/L脫脂奶粉、鼠或兔抗人抗體(細胞周期蛋白D1、c-Jun和GADPH)I抗4℃孵育過夜，過氧化物酶偶聯(lián)的II抗孵育，運用ECL Western blotting Kit顯色并掃描實驗結果。

2.3 UMUC3細胞的細胞周期蛋白D1 mRNA水平表達的檢測 以ISO預處理膀胱癌細胞(約1×106細胞)后，收集按 TRIzolTM試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄反應體系:模板RNA 2 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNA 酶抑制劑(RNasin)335 nKat，Oligo dT181 μL，AMV 逆轉錄酶1 μL，5 ×逆轉錄酶緩沖液5 μL，終體積為 25 μL。42 ℃水浴30 min，采用NCBI的Primer-BLAST軟件設計細胞周期蛋白D1基因的PCR引物(擴增產物大小408 bp)，序列如下:上游引物 5’-GAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTG-3’，下游引物 5’-GAGGGCGGATTGGAAATGAACTTC-3’。同時以GADPH作為內參照(擴增產物大小258 bp)，上游引物 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下 游 引 物 5 ’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3 ’［9］。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。

待到中午下班后，楊力生在室內檢查了一下員工們的工作情況，檢查完畢，員工們早已走盡。他走出門外，正準備開車回家，卻見楊秋香獨自站在大門口的一棵銀杏樹下，她一見到楊力生便含羞地低下頭來。楊力生趕忙走到她近前，心情激動地問道：

2.4 PI染色法和流式細胞術檢測細胞周期 以ISO預處理膀胱癌細胞(約1×106細胞)后，胰酶消化并收集細胞，70%乙醇固定，4℃保存。600×g離心5 min，并用 PBS液(含有0.5%BSA和0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測細胞周期DNA含量和凋亡細胞百分數。

2.5 貼壁依賴性細胞生長實驗 在6孔培養(yǎng)板內，制備含0.5%軟瓊脂、10%胎牛血清、不同濃度ISO底層的Basal Medium Eagle(BME)培養(yǎng)基底層。靜置4 h凝固后，1×104UMUC3細胞混懸于含10%胎牛血清、0.33%軟瓊脂培養(yǎng)基和不同濃度ISO的BME培養(yǎng)基，凝固后，6孔板被保持在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d后，顯微鏡下計數細胞集落數超過32個的細胞克隆數，觀察菌落及鏡下計數。每個濃度分別進行3次獨立的實驗［9］。

2.6 螢光素酶報告基因分析 穩(wěn)定轉染GFP標記的細胞周期蛋白D1表達構建載體、Sp1mut-cyclin D1-Luc和WT-cyclin D1-Luc報告基因質粒載體至UMUC3膀胱癌細胞，經篩選鑒定后，接種到96孔板(1×104cells/well)，當細胞密度達到80% ～90%，給予ISO預處理后，在相對應的時間收集細胞，加入細胞裂解液［25 mmol/L Tris-磷酸(pH 7.8)、2 mmol/L EDTA、1%Triton X-100和10%甘油］，使用螢光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)和微孔板光度計(Berthold LB 96V)檢測細胞的螢光素酶活性。每個濃度分別進行3 次獨立的實驗［10］。

2.7 核蛋白提取及Western blotting法檢測核轉錄因子 UMUC3細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，ISO預處理12 h后，以核/細胞質分離試劑盒(BioVision)所提供的試劑說明書進行操作，提取細胞的核蛋白和胞漿蛋白，并進行定量，在-80℃冰箱內保存。按照Western blotting法，每孔分別上樣40 μg胞漿蛋白和核蛋白，檢測核轉錄因子變化情況。

2.8 染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP) 根據ChIP試劑盒(Millipore)提供的說明書進行操作。即UMUC3細胞以DMSO處理或ISO(5 μmol/L)預處理12 h后，對細胞的基因組DNA和蛋白質進行分離。針對人源性細胞周期蛋白D1啟動子的Sp1結合區(qū)域，采用PCR擴增引物［上游引物5’-TTCTCTGCCCGGCTTTGATCTC-3′(從 -92 到-73)，下游引物 5’-CTCTCTGCTACTGCGCCAACA-3’(從+7到+27)］進行擴增。擴增后的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙啶染色，并進行紫外光掃描［9］。

3 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。對各組之間采用t檢驗或方差分析，SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 ISO可顯著抑制多種膀胱癌細胞內的細胞周期蛋白D1的表達

將UMUC3、RT112和RT4細胞與不同劑量(0～20 μmol/L)ISO培養(yǎng)24 h后，收集膀胱癌細胞的蛋白質，經 Western blotting檢測均可見，5、10和 20 μmol/L ISO呈劑量依賴性地抑制細胞周期蛋白D1的表達(P＜0.01)，見圖1。由于UMUC3膀胱癌細胞株有較強的轉移傾向，并且高表達細胞周期蛋白D1，所以選定該細胞株進行后續(xù)的實驗。

Figure 1.ISO inhibited cyclin D1 protein expression in different human bladder cancer cells.Cyclin D1 protein expression was determined by Western blotting after the cells were treated with the indicated concentrations of ISO for 24 h.圖1 ISO可顯著抑制多種膀胱癌細胞內細胞周期蛋白D1的表達

2 ISO可下調膀胱癌細胞細胞周期蛋白D1基因轉錄水平和Sp1核轉錄因子水平

如圖2A所示，不同劑量(0～20 μmol/L)ISO作用24 h可顯著下調UMUC3細胞細胞周期蛋白D1 mRNA的表達。以上結果表明，ISO預處理可在轉錄水平或mRNA的穩(wěn)定性水平抑制細胞周期蛋白D1的表達。為此，將細胞周期蛋白D1啟動子驅動的螢光素酶報告基因穩(wěn)定轉染到UMUC3細胞，檢測ISO對細胞周期蛋白D1轉錄活性的影響。如圖2B所示，ISO可呈時間依賴性地抑制UMUC3細胞中細胞周期蛋白D1啟動子的轉錄活性。

接著，我們使用TRANSFAC?轉錄因子結合位點軟件(7.0版)，對細胞周期蛋白D1的啟動子區(qū)域進行分析，檢索參與調控的核轉錄因子。結果表明，人類細胞周期蛋白D1基因的啟動子區(qū)域包含多個潛在的轉錄因子DNA結合位點，主要包括激活蛋白1、熱休克轉錄因子 1、激活轉錄因子 2、NF-κB 和Sp1。如圖2C所示，ISO(5 μmol/L)預處理 UMUC3膀胱癌細胞后，分別收集核蛋白和胞漿蛋白，經Western blotting檢測均可見分子量為106 kD的Sp1核轉錄因子受到顯著抑制，而其它核轉錄因子如c-Jun等無顯著改變。

Figure 2.ISO down-regulated cyclin D1 transcription and Sp1 protein expression.A:total RNA isolated from the UMUC3 cells treated with the indicated concentrations of ISO for 24 h was subjected to RT-PCR for determination of cyclin D1 mRNA expression level，and GAPDH was used as a loading control;B:UMUC3 stably transfected with cyclin D1 promoter-driven luciferase reporter was treated with ISO(5 μmol/L)for the indicated time to determine the inhibitory effect of ISO on cyclin D1 promoter transcriptional activity;C:cytoplasmic and nuclear extracts were isolated from the UMUC3 cells treated with either 0.1%DMSO or 5 μmol/L ISO for 12 h and were subjected to Western blotting，with the specific antibodies as indicated.GAPDH was used as protein loading control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖2 ISO可下調UMUC3膀胱癌細胞周期蛋白D1的轉錄水平和核轉錄因子Sp1水平

3 ISO不影響外源性GFP-細胞周期蛋白D1表達

分別穩(wěn)定轉染GFP以及GFP-細胞周期蛋白D1到膀胱癌UMUC3細胞，經篩選鑒定后，進一步檢測ISO對內源性和外源性細胞周期蛋白D1的表達、腫瘤細胞增殖和細胞周期的影響。如圖3A所示，因GFP-細胞周期蛋白D1不含內源性啟動子，ISO預處理后，可顯著下調內源性細胞周期蛋白D1的表達，而不影響外源性GFP-細胞周期蛋白D1表達。進一步通過貼壁依賴性生長實驗檢測(圖3B、C)，證實ISO可顯著抑制穩(wěn)定轉染GFP的UMUC3細胞的增殖，但對穩(wěn)定轉染GFP-細胞周期蛋白D1的UMUC3細胞的增殖影響較小。通過流式細胞術檢測，10 μmol/L ISO可誘導穩(wěn)定轉染GFP的UMUC3細胞出現(xiàn)G0/G1細胞周期阻滯(65.59%±2.52% vs 83.81% ±3.48%)，而對穩(wěn)定轉染GFP-細胞周期蛋白D1的UMUC3細胞的G0/G1細胞周期影響較小(55.52% ±3.24%vs 59.49% ±3.76%)，見圖3D。這些結果表明，ISO可通過調控內源性轉錄水平來下調細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制膀胱癌細胞的生長能力，并誘導癌細胞G0/G1期阻滯。

Figure 3.Exogenous expression of GFP-cyclin D1 was not inhibited by ISO and was able to reverse ISO-mediated inhibition of anchorage-independent growth of UMUC3 cells.A:UMUC3 stable transfectants，as indicated，were treated with ISO for 24 h，and the cells were extracted for detection of cyclin D1 protein expressions by Western blotting;B，C:UMUC3 stable transfectants were subjected to anchorage-independent growth assay as indicated in soft agar in the absence or presence of 10 μmol/L of ISO;D:UMUC3 stable transfectants，as indicated，were subjected to cell cycle analysis using flow cytometry after pretreatment with ISO for 48 h.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖3 外源性GFP-細胞周期蛋白D1穩(wěn)定轉染UMUC3細胞后，ISO不能下調外源性細胞周期蛋白D1的表達水平，也不能抑制ISO所介導的細胞增殖

4 ISO通過抑制核轉錄因子Sp1與細胞周期蛋白D1的啟動子結合，從內源性轉錄水平來抑制細胞周期D1的表達

圖4 A顯示細胞周期蛋白D1啟動子區(qū)與轉錄因子Sp1結合位點示意圖。Marampon等［8］證實，刪除了細胞周期蛋白D1的-163到-22啟動子序列，將顯著降低細胞周期蛋白D1啟動子活性。為進一步研究ISO所調控的細胞周期蛋白D1的啟動子序列，我們將WT-cyclin D1-Luc和Sp1mut-cyclin D1-Luc分別與pSUPER質粒共轉染UMUC3細胞，篩選并建立UMUC3/WT-cyclin D1-Luc和UMUC3/Sp1mut-cyclin D1-Luc細胞系，以ISO(5 μmol/L)處理UMUC3膀胱癌細胞6 h、12 h和24 h后，檢測UMUC3細胞中細胞周期蛋白 D1啟動子活性。如圖4B所示，UMUC3/Sp1mut-cyclin D1-Luc細胞系的細胞周期蛋白D1啟動子活性明顯低于UMUC3/WT-cyclin D1-Luc的啟動子活性(P＜0.01)。這一結果證實ISO通過特異性抑制核轉錄因子Sp1及相應的轉錄功能來下調細胞周期蛋白D1的轉錄。

Marampon等［8］亦證實，Sp1 調控人細胞周期蛋白D1表達的作用位點主要位于細胞周期蛋白D1啟動子-92到+27 bp的5′-非翻譯區(qū)。為了進一步檢測ISO對核轉錄因子Sp1與細胞周期蛋白D1啟動子特異性結合的影響，我們以ISO(5 mol/L)處理UMUC3細胞12 h，采用ChIP法收集DNA，使用針對細胞周期蛋白D1啟動子-92到+27 bp區(qū)域的PCR引物進行擴增。如圖4C所示，ISO(5 mol/L)可特異性抑制Sp1與細胞周期蛋白D1啟動子-92到+27 bp區(qū)域的結合。根據上述結果，ISO的作用機制可總結如下:ISO可抑制并下調核轉錄因子Sp1的表達，并通過抑制Sp1與細胞周期蛋白D1啟動子-92到+27 bp的5′-非翻譯區(qū)結合，下調細胞周期蛋白D1的轉錄水平，從而誘導腫瘤細胞G0/G1期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖，見圖4D。

Figure 4.Sp1 was a major target of ISO for its inhibitory effect on cyclin D1 transcription.A:schematic diagram of transcription factor Sp1-binding sites in human cyclin D1 promoter region;B:wild-type cyclin D1 luciferase reporter(WT-cyclin D1-Luc)or its mutant at one of the Sp1-binding sites(-163)in cyclin D1 promoter region(Sp1mut-cyclin D1-Luc)was cotransfected with pSUPER plasmid into UMUC3 cells，and the stable transfectants were exposed to ISO(5 μmol/L)for determination of cyclin D1 promoter activity;C:ChIP assay was used to analyze the effect of ISO on Sp1 binding activity to cyclin D1 promoter region;D:the proposed model of ISO regulating cyclin D1 expression in human bladder cancer cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs WT-cyclin D1-Luc.圖5 ISO通過抑制核轉錄因子Sp1蛋白與細胞周期蛋白D1啟動子的結合來抑制其內源性轉錄水平

討 論

泌尿系統(tǒng)來源的膀胱上皮腫瘤是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，晚期患者的治療效果仍不理想［1，11-12］。既往的一些研究表明，ISO可通過對氧化型低密度脂蛋白的抑制作用(OxLDL)來抑制牛主動脈平滑肌細胞的有絲分裂增殖［13］，并且具備抗氧化和抗心血管炎癥反應［14］。但ISO抗腫瘤的作用機制研究接近于空白。我們新近的研究結果證實，當ISO濃度超過20 μmol/L時可通過下調膀胱癌細胞的X染色體連鎖凋亡抑制蛋白水平，誘導腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞增殖［9］。ISO濃度低于20 μmol/L時，雖然沒有顯示出明顯的細胞毒作用，但卻可下調細胞周期蛋白D1表達，抑制膀胱癌細胞增殖［5］。其具體分子機制不明。通過開展本研究，將進一步深入了解中藥買麻藤屬及其分離出的單體ISO的抗癌活性的分子機制。

細胞周期蛋白D1為細胞內主要的癌基因之一，又稱 PRAD1、CCND1或 BCL-1，它位于 11q13，長約15 kb，含5個外顯子，4個內含子，編碼的蛋白含295個氨基酸殘基，分子量37 kD［15］。在惡性腫瘤的形成過程中，細胞周期蛋白D1比細胞周期蛋白D2和D3更加重要［16］。多個研究證據表明，在包括致癌物質在內的各種促進細胞炎癥增殖反應、誘導細胞突變的過程中，可首先引起細胞周期蛋白的改變。其中細胞周期蛋白D1的過度表達是惡性腫瘤過度增殖的主要原因;在包括膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、結腸癌、前列腺癌和皮膚癌等多種常見腫瘤，均可檢測到細胞周期蛋白D1的過度表達［17］。因此，細胞周期蛋白D1是一種最常見的腫瘤細胞的細胞周期調節(jié)蛋白，是一個潛在的治療靶點［18］。

本系列研究證實，ISO在濃度為5 μmol/L水平，就可在轉錄水平下調細胞周期蛋白D1的表達，并誘導腫瘤細胞的G0/G1期阻滯，并可抑制膀胱癌細胞的增殖，但并不影響其細胞活力或其它細胞周期調控蛋白的表達，包括細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B、細胞周期蛋白 E、CDK4 和 CDK6［5］。這些結果表明ISO可作為一種潛在的、以細胞周期蛋白D1為靶點的藥物用于預防和治療腫瘤;并對多種異常高表達細胞周期蛋白D1的腫瘤患者，嘗試采用ISO治療具備相應的臨床基礎。

研究證實，可以在轉錄和轉錄后水平來調控細胞周期蛋白D1的表達水平［19］。通過本試驗的一系列研究，證實ISO可通過轉錄水平對細胞周期蛋白D1進行調控。至目前為止，已被報道調節(jié)細胞周期蛋白 D1轉錄水平的核轉錄因子包括 NF-κB［20］、Sp1［21］、Ras/MAPK/Akt/ERK1/2［22］、PI3K/Akt［23，24］和 GSK-3β/β-catenin［25］。Sp1 是一個重要的核轉錄因子，可直接與啟動子結合來參與包括細胞周期蛋白D1在內的多種基因的表達和細胞功能的調節(jié)［26］。本研究證實，ISO可抑制并下調核轉錄因子Sp1的表達，并介導抑制Sp1與細胞周期蛋白D1啟動子區(qū)域結合，該結合位點主要位于啟動子的-92和+27 bp的5’-非翻譯區(qū)。通過下調細胞周期蛋白D1的轉錄水平，ISO可進一步誘導腫瘤細胞G0/G1期阻滯并抑制其增殖。細胞周期蛋白D1是腫瘤細胞周期調控及藥物治療中潛在的治療靶點。因此，本研究將對ISO用于預防和治療高表達細胞周期蛋白D1的多種人類腫瘤奠定理論基礎。同時，本研究也將為治療膀胱癌和其它腫瘤提供新的思路和治療策略，為進一步研究細胞周期蛋白D1基因在參與實體腫瘤細胞遷移、腫瘤細胞G0/G1周期調控中的作用提供了新的思路和策略。

本研究還有不足之處。如對PCR結果沒有采用real-time PCR檢測;ISO可在內源性轉錄水平下調細胞周期蛋白D1表達，尚需進一步地通過動物的體內實驗去證實;本文通過ChIP實驗證實ISO可特異性抑制Sp1與細胞周期蛋白D1啟動子區(qū)域(-92到+27 bp)的結合，還需要其它實驗如凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)來證實。另外，ISO未對細胞內其它細胞周期調控蛋白如CDK產生影響，但對其它信號轉導途徑如JNK/c-Jun、JAK/STAT等是否產生影響，有待下一步研究。

［1］ Shariat SF，Ashfaq R，Sagalowsky AI，et al.Correlation of cyclin D1 and E1 expression with bladder cancer presence，invasion，progression，and metastasis ［J］.Hum Pathol，2006，37(12):1568-1576.

［2］ Yuan L，Gu X，Shao J，et al.Cyclin D1 G870A polymorphism is associated with risk and clinicopathologic characteristics of bladder cancer［J］.DNA Cell Biol，2010，29(10):611-617.

［3］ Yamada M，Hayashi K，Ikeda S，et al.Inhibitory activity of plant stilbene oligomers against DNA topoisomerase II［J］.Biol Pharm Bull，2006，29(7):1504-1507.

［4］ Hagiwara K，Kosaka N，Yoshioka Y，et al.Stilbene derivatives promote Ago2-dependent tumour-suppressive microRNA activity［J］.Sci Rep，2012，2:314.

［5］ 方 勇，侯 琦，盧 瑜.異丹葉大黃素下調膀胱癌細胞的細胞周期蛋白D1表達并誘導G0/G1細胞周期阻滯［J］.中國病理生理雜志，2013，29(3):442-448.

［6］ Zhang J，Ouyang W，Li J，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA)inhibits EGF-induced cell transformation via reduction of cyclin D1 mRNA stability［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，263(2):218-224.

［7］ Jenkins TD，Mueller A，Odze R，et al.Cyclin D1 overexpression combined with N-nitrosomethylbenzylamine increases dysplasia and cellular proliferation in murine esophageal squamous epithelium ［J］.Oncogene，1999，18(1):59-66.

［8］ Marampon F，Casimiro MC，F(xiàn)u M，et al.Nerve growth factor regulation of cyclin D1 in PC12 cells through a p21RASextracellular signal-regulated kinase pathway requires cooperative interactions between Sp1 and nuclear factor-kappaB ［J］.Mol Biol Cell，2008，19(6):2566-2578.

［9］ Fang Y，Yu Y，Hou Q，et al.The Chinese herb isolate isorhapontigenin induces apoptosis in human cancer cells by down-regulating overexpression of antiapoptotic protein XIAP［J］.J Biol Chem，2012，287(42):35234-35243.

［10］Fang Y，Cao Z，Hou Q，et al.Cyclin D1 downregulation contributes to anticancer effect of isorhapontigenin on human bladder cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2013，12(8):1492-1503.

［11］ Kaufman DS，Shipley WU，F(xiàn)eldman AS.Bladder cancer［J］.Lancet，2009，374(9685):239-249.

［12］ Gerullis H，Ecke TH，Janusch B，et al.Long-term re-sponse in advanced bladder cancer involving the use of temsirolimus and vinflunine after platin resistance［J］.Anticancer Drugs，2011，22(9):940-943.

［13］ Liu Y，Liu G.Isorhapontigenin and resveratrol suppress oxLDL-induced proliferation and activation of ERK1/2 mitogen-activated protein kinases of bovine aortic smooth muscle cells ［J］.Biochem Pharmacol，2004，67(4):777-785.

［14］ Li HL，Wang AB，Huang Y，et al.Isorhapontigenin，a new resveratrol analog，attenuates cardiac hypertrophy via blocking signaling transduction pathways［J］.Free Radic Biol Med，2005，38(2):243-257.

［15］ Heighway J.HaeIII polymorphism within 3′untranslated region of PRAD1 ［J］.Nucleic Acids Res，1991，19(19):5451.

［16］Takaba K，Saeki K，Suzuki K，et al.Significant overexpression of metallothionein and cyclin D1 and apoptosis in the early process of rat urinary bladder carcinogenesis induced by treatment with N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine or sodium L-ascorbate ［J］.Carcinogenesis，2000，21(4):691-700.

［17］ Kim JK，Diehl JA.Nuclear cyclin D1:an oncogenic driver in human cancer［J］.J Cell Physiol，2009，220(2):292-296.

［18］ Lehn S，Tobin NP，Berglund P，et al.Down-regulation of the oncogene cyclin D1 increases migratory capacity in breast cancer and is linked to unfavorable prognostic features［J］.Am J Pathol，2010，177(6):2886-2897.

［19］ Musgrove EA.Cyclins:roles in mitogenic signaling and oncogenic transformation ［J］.Growth Factors，2006，24(1):13-19.

［20］Klein EA，Yang C，Kazanietz MG，et al.NFkappaB-independent signaling to the cyclin D1 gene by Rac［J］.Cell Cycle，2007，6(9):1115-1121.

［21］ Bartusel T，Schubert S，Klempnauer KH.Regulation of the cyclin D1 and cyclin A1 promoters by B-Myb is mediated by Sp1 binding sites［J］.Gene，2005，351:171-180.

［22］ Liu Y，Hock JM，Sullivan C，et al.Activation of the p38 MAPK/Akt/ERK1/2 signal pathways is required for the protein stabilization of CDC6 and cyclin D1 in low-dose arsenite-induced cell proliferation ［J］.J Cell Biochem，2010，111(6):1546-1555.

［23］Ouyang W，Luo W，Zhang D，et al.PI-3K/Akt pathwaydependent cyclin D1 expression is responsible for arseniteinduced human keratinocyte transformation［J］.Environ Health Perspect，2008，116(1):1-6.

［24］ Vartanian R，Masri J，Martin J，et al.AP-1 regulates cyclin D1 and c-MYC transcription in an AKT-dependent manner in response to mTOR inhibition:role of AIP4/Itch-mediated JUNB degradation ［J］.Mol Cancer Res，2011，9(1):115-130.

［25］ D′Amico M，Hulit J，Amanatullah DF，et al.The integrinlinked kinase regulates the cyclin D1 gene through glycogen synthase kinase 3beta and cAMP-responsive elementbinding protein-dependent pathways［J］.J Biol Chem，2000，275(42):32649-32657.

［26］ Seznec J，Silkenstedt B，Naumann U.Therapeutic effects of the Sp1 inhibitor mithramycin A in glioblastoma［J］.J Neurooncol，2011，101(3):365-377.