吠喃西林及其代謝物氨基脲的檢測(cè)技術(shù)研究

張小軍，王 建，嚴(yán)忠雍，龍 舉，張 虹

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所,浙江舟山 316021; 2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310015）

·綜 述·

吠喃西林及其代謝物氨基脲的檢測(cè)技術(shù)研究

張小軍1，王 建2，嚴(yán)忠雍1，龍 舉1，張 虹2

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所,浙江舟山 316021; 2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310015）

呋喃西林（NFZ）作為硝基呋喃的一種,曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),但因其致癌和致畸性現(xiàn)已被世界上多個(gè)國(guó)家所禁止。由于呋喃西代謝物可與組織結(jié)合形成穩(wěn)定化合物而難以降解,其檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越受到重視。本文綜述了呋喃西林原藥及其代謝物氨基脲（SEM）的檢測(cè)方法,在闡明各種檢測(cè)研究方法原理的基礎(chǔ)上,從測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性、檢出限和適用范圍等方面進(jìn)行了分析比較,旨在促進(jìn)呋喃唑酮及其代謝物的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展。

呋喃西林;氨基脲;檢測(cè)方法

四種硝基呋喃類藥物——呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃妥因(Nitrofurantion,NFT)和呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ),曾經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于家畜和家禽的飼養(yǎng)中,用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染引起的腸道感染疾病[1]。呋喃西林作為硝基呋喃類藥物典型代表,因其殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格低廉、療效好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。氨基脲(Semicarbazide,SEM),又名氨基甲酰肼,化學(xué)分子式為CH5N3O。通常認(rèn)為氨基脲是養(yǎng)殖常用藥物呋喃西林在動(dòng)物體內(nèi)的典型代謝物,由于性質(zhì)穩(wěn)定,目前歐盟、美國(guó)和我國(guó)均以SEM作為標(biāo)示殘留物對(duì)呋喃西林進(jìn)行殘留檢測(cè)和監(jiān)控[2],其結(jié)構(gòu)如圖1所示。近年來(lái)的研究表明呋喃西林及其代謝物在動(dòng)物源性食品中的殘留可以通過(guò)食物鏈傳遞給人類,長(zhǎng)期攝入會(huì)引發(fā)多種不良影響:溶血性貧血、多發(fā)性神經(jīng)炎、眼部損害和急性肝壞死等疾病,產(chǎn)生自由氧及其衍生自由基損傷DNA,并且在小鼠口服喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)嚴(yán)重的血管瘤和肺癌等疾病,嚴(yán)重危害人體健康[3-7]。

圖1 吠喃西林及其代謝物氨基脲的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of nitrofurazone and itsmetabolite semicarbazide

鑒于硝基呋喃及其代謝物的危害,目前在世界范圍內(nèi)包括美國(guó)、日本、歐盟、中國(guó)等大部分國(guó)家均禁止其用于養(yǎng)殖,并先后制定了相應(yīng)的殘留限量對(duì)食品進(jìn)行嚴(yán)格的殘留監(jiān)控。歐盟將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物列為A類禁用藥物,規(guī)定在動(dòng)物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出[8];2007年日本厚生勞動(dòng)省《食品、添加物的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)的部分修正件》(2007年厚生勞動(dòng)省告示第206號(hào))和我國(guó)于2002年頒布農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》,規(guī)定食品中硝基呋喃類藥物不得檢出;另外,其他國(guó)家如澳大利亞(1993),菲律賓(2001),巴西(2002),泰國(guó)(2002)以及美國(guó)(2002)也進(jìn)行限定[9-10]。

呋喃西林作為硝基呋喃藥物一種,常與其他三種硝基呋喃類藥物一同檢測(cè)。在非動(dòng)物源性食品中直接進(jìn)行原藥的檢測(cè),如常規(guī)的動(dòng)物飼料等。但由于硝基呋喃類藥物在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)代謝速度較快,藥物半衰期很短,在動(dòng)物體內(nèi)能迅速代謝[11],在評(píng)估動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物殘留過(guò)程中,只檢測(cè)其原藥顯然不夠科學(xué),而其代謝物與蛋白結(jié)合能產(chǎn)生穩(wěn)定的殘留,常用的食品烹飪方法如蒸煮、煎炸、烘烤和微波加熱等均無(wú)法使代謝物完全降解[12-13]。因此針對(duì)動(dòng)物源性食品中包括呋喃西林在內(nèi)的硝基呋喃類藥物的檢測(cè)多是以代謝物殘留的檢測(cè)完成的。

1 基于呋喃西林原約的檢測(cè)方法

1.1 紫外分光光度法

該方法主要用于對(duì)非處方和處方藥劑中添加的呋喃西林原藥含量的檢測(cè),其操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)方便。歐翠華等[14]選擇375 nm作為呋喃西林含量測(cè)定波長(zhǎng)將此種方法應(yīng)用于藥劑中呋喃西林的檢測(cè),結(jié)果顯示呋喃西林檢測(cè)濃度的線性范圍為1.05～12.6 g/mL,RSD=0.07%。但由于該方法靈敏度較低檢出限高,只能達(dá)到g/mL數(shù)量級(jí)，目前較少應(yīng)用在殘留分析領(lǐng)域。

1.2 高效液相色譜方法

液相色譜方法(HPLC)可以建立飼料中呋喃西林以及其他硝基呋喃類藥物原藥的準(zhǔn)確、靈敏的定性定量檢測(cè)。賈濤[15]利用配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和紫外檢測(cè)器（UV）的高效液相色譜儀對(duì)配合飼料和添加劑預(yù)混合飼料飼料中硝基呋喃類藥物原藥殘留進(jìn)行測(cè)定。方法用乙腈提取,再經(jīng)固相萃取柱凈化,2%甲酸lmL復(fù)容,過(guò)濾膜供高效液相色譜測(cè)定結(jié)果顯示該方法可有效測(cè)定對(duì)配合飼料和添加劑預(yù)混合飼料中呋喃西林原藥。方法檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)分別為150μg/kg和300μg/kg,平均回收率在90.1%～98.5%,日內(nèi)變異系數(shù)在2.0%～6.0%,日問(wèn)變異系數(shù)在5.2%～8.2%之間。曹鵬等[16]利用DAD檢測(cè)器進(jìn)行了飼料中包括呋喃西林在內(nèi)的硝基呋喃類藥物的檢測(cè),采用乙腈提取，經(jīng)正己烷和酸性氧化鋁凈化，有效簡(jiǎn)化了前處理方法。流動(dòng)相采用乙腈-磷酸水溶液可有效分離目標(biāo)物。方法的LOD和LOQ分別為250μg/ kg、500μg/kg。

HPLC法對(duì)呋喃西林原藥進(jìn)行檢測(cè),可滿足飼料等簡(jiǎn)單基質(zhì)的檢測(cè),但樣品前處理一般較麻煩,LOD和LOQ值都較高,此方法無(wú)法滿足動(dòng)物源性食品中SEM的檢測(cè)。

1.3 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)

流動(dòng)注射分析法(flow injection analysis,FI)是指在熱力學(xué)非平衡條件下,在液流中重現(xiàn)處理試樣或試劑區(qū)帶的定量流動(dòng)分析技術(shù)，化學(xué)發(fā)光分析法(chemiluminescence analysis,CL)主要是依據(jù)化學(xué)檢測(cè)體系中待測(cè)物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理,利用儀器對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè),而確定待測(cè)物含量的一種痕量分析方法。將CL與FI相結(jié)合而形成的FI-CL分析法大幅度提高檢測(cè)性能,并且具有分析速度快(0.1～10 s)、精度高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)，這種方法被應(yīng)用到呋喃西林的檢測(cè)中。

根據(jù)H2O2和NBS(N-bromosuccinimide,溴代丁二酰亞胺)反應(yīng)產(chǎn)生單態(tài)氧,單態(tài)氧可以與NFZ化學(xué)反應(yīng)生成具有強(qiáng)烈的CL信號(hào)的NFZ衍生物的原理,DU等[17]首次進(jìn)行了FI-CL方法對(duì)呋喃西林檢測(cè)的方法學(xué)驗(yàn)證,成功應(yīng)用于復(fù)合呋喃西林滴鼻液、人血漿和尿液的檢測(cè)中。方法在0.04mol/LH2O2和0.01mol/ L NBS溶液中以2.1mL/min流速獲得最強(qiáng)信號(hào),NFZ檢測(cè)范圍為1.0×10-7～1.0×10-5g/mL,檢出限可達(dá)到2×10-8g/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%。THONGSRISOMBOON等[18]以高錳酸鉀-硫酸(2.5×10-5mol/L)作為發(fā)光體系,建立了家禽畜飼料中呋喃西林藥物殘留的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法,并與HPLC方法進(jìn)行了驗(yàn)證對(duì)比,兩種方法具有很好的一致性。該方法檢測(cè)限可達(dá)到0.25mg/L,精密度進(jìn)一步提高達(dá)到1.83%,適用于動(dòng)物飼料工廠實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)分析。

2 呋喃西林代謝物氨基脲的檢測(cè)方法

2.1 毛細(xì)管色譜分析方法

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(micellar electrokinetic capillary Chromatography,MECC)具有很好的分離純化條件,因其分辨率高、寬泛的可優(yōu)化操作條件、較短的分析時(shí)間、樣品與試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)已被用來(lái)進(jìn)行呋喃西林代謝物的分離和檢測(cè)。

WICKRAMANAYAKE等[19]利用硝基呋喃和其代謝物有發(fā)光團(tuán)的存在的特性,通過(guò)2-NBA衍生化,建立了呋喃西林及其代謝物的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜檢測(cè)方法。方法以脫氧膽酸鈉（80 mm）為膠束表面活性劑,以20mM硼酸和20mM磷酸為緩沖液,通過(guò)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了最佳條件。方法靈敏度呋喃西林LOD可達(dá)到1.6μg/mL,SEM可達(dá)0.4μg/mL。

2.2 高效液量色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

在NFZ的液相色譜檢測(cè)中,質(zhì)譜因其較低檢測(cè)限和可選擇性逐漸替代了UV檢測(cè)器,應(yīng)用越來(lái)越廣泛。自2001年LEITNER等[2]第一次運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用,對(duì)于動(dòng)物食源性樣品的NFZ代謝物SEM檢測(cè)多數(shù)都是基于此種方法。作為NFZ的代謝物,SEM在食源性樣品中多呈現(xiàn)蛋白結(jié)合的形式,這種新式可以穩(wěn)定存在幾周,在微酸條件下,SEM從蛋白上釋放在與加入的2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)衍生化生成衍生化樣品,總SEM含量進(jìn)行測(cè)定。為了提高分析定量的效果,內(nèi)標(biāo)加入到樣品中,隨SEM一起在HCl條件下進(jìn)行衍生化。最初,4-硝基苯甲醛(4-NBA)作為添加的內(nèi)標(biāo)[2],這種內(nèi)標(biāo)的缺點(diǎn)是必須在2-NBA衍生化以后加入以防止兩者在酸性條件下反應(yīng),4-NBA-SEM響應(yīng)相對(duì)較低,在質(zhì)譜中2-NBA和4-NBA衍生化物質(zhì)都有m/z 209→192,容易造成模糊或者錯(cuò)誤的解析,而氘代內(nèi)標(biāo)可以避免這種錯(cuò)誤,因此現(xiàn)在應(yīng)用的內(nèi)標(biāo)多為13C15N2-SEM[20-22]或者d4-SEM[23]。在此基礎(chǔ)上,一些研究[24-25]將這種方法用于面制品和嬰兒制品中SEM的檢測(cè),取得了較好效果。

HPLC-MS/MS法作為一種精確、穩(wěn)定的確證方法使用,因其靈敏快速、分辨率高、重現(xiàn)性好而得到廣泛使用,缺點(diǎn)就是成本高,需要配備價(jià)格高昂的質(zhì)譜檢測(cè)器,不易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查,很難在基層推廣使用。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫分析法是新開(kāi)發(fā)的一種方法,通過(guò)抗體與酶復(fù)合物結(jié)合,然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)。測(cè)量時(shí),抗原先結(jié)合在固相載體上,加一種抗體與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物(標(biāo)記物),此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性,當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原反應(yīng)結(jié)合后,再加上酶的相應(yīng)底物,即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色,其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原含量成正比。這種方法方便訊速,特異性強(qiáng)并且靈敏度高、特異性好,不需要繁瑣的樣品前處理,可以在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)篩選大量的樣品。實(shí)際運(yùn)用的過(guò)程中可以結(jié)合將ELISA方法作為篩選方法,再將HPLC-MS/MS法作為確證性方法聯(lián)合使用。

GAO等[26]首先制備得到用于檢測(cè)SEM的單克隆抗體（mAb）。以羧基苯甲醛-SEM(CP-SEM)作為半抗原，經(jīng)純化后分別與牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備免疫原和包被原免疫小鼠,獲得了針對(duì)CP-SEM的特異性高效抗性蛋白,這種方法對(duì)SEM檢測(cè)線達(dá)到0.01μg/L,IC50為1.3μg/kg。COOPER等[27]建立了基于多克隆的抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,這種方法快速、簡(jiǎn)便,并且特異性針對(duì)SEM,而對(duì)呋喃西林(1.7%)和其他硝基呋喃類藥物(＜0.01%)交叉反應(yīng)率較低。以SEM的衍生物CP-SEM作為半抗原提高多克隆抗體,利用間接ELISA法對(duì)雞肌肉組織中的SEM進(jìn)行檢測(cè),并與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果對(duì)照基本一致,靈敏度為0.25μg/kg,遠(yuǎn)低于歐盟規(guī)定的檢出限。VASS等[28]制備了5種CP-SEM的抗體,IC50為0.06～2.28μg/L之間,其中MVK39抗體在間接Elisa上表現(xiàn)高動(dòng)量范圍0.01～0.2μg/L,MVK31在直接Elisa為IC50=0.14μg/L,用這些制備的抗體對(duì)嬰兒食品進(jìn)行檢測(cè),并以液質(zhì)聯(lián)用方法作為比對(duì),結(jié)果表現(xiàn)出極大的相關(guān)性。

采用ELISA法檢測(cè)動(dòng)物組織中SEM具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確并且不需要特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備等優(yōu)點(diǎn),適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。目前,國(guó)內(nèi)外用于檢測(cè)SEM的商品化試劑盒已經(jīng)上市[29]。

2.4 熒光偏振免疫檢測(cè)方法

熒光偏振免疫分析技術(shù)（FPIA）是一種均相熒光免疫分析法,將其運(yùn)用到呋喃西林的檢測(cè)上來(lái),具有操作步驟簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制和現(xiàn)場(chǎng)快速篩查等優(yōu)點(diǎn),可滿足快速檢測(cè)的要求。沈玉棟等[30]利用實(shí)驗(yàn)室制備的抗體建立了SEM的FPIA方法:通過(guò)設(shè)計(jì)合成新的SEM半抗原2-（4-（2-rarbamoylhydrazono）methyl）phenoxy）acetic acid(CEPSEM),偶聯(lián)載體蛋白后進(jìn)行免疫新西蘭大白兔,獲得親和力高、特異性好的NPSEM多克隆抗體,最后結(jié)合設(shè)計(jì)合成的2種新熒光示蹤物CEPSEM-EDF和CEPSEM-HDF建立了SEM的FPIA方法。結(jié)果表明:在示蹤物濃度為0.5 nmol/L,抗體稀釋度為l/100的優(yōu)化條件下,檢出限為8.3μg/L,線性范圍為15.8～145.7μg/L。該方法對(duì)于一般非食源性樣品的檢測(cè)已經(jīng)滿足,對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品則需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化,提高方法靈敏度，以滿足食源性樣品的分析檢測(cè)。

2.5 生物傳感器技術(shù)

JOHN等[31]采用多路復(fù)用生物芯片掃描分析對(duì)134種不同產(chǎn)地的蜂蜜進(jìn)行呋喃西林代謝物SEM的篩查檢測(cè)。此方法前期處理與液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法類似,以O(shè)asisTMSPE柱進(jìn)行分離純化,進(jìn)行2-NBA衍生化和乙酸乙酯提取,最后用Randox Evidence Investigator分析儀進(jìn)行分析。這種生物芯片可以準(zhǔn)確篩查出硝基呋喃類代謝物,其中SEM為0.9μg/kg,IC50達(dá)到2.19μg/kg。結(jié)果用HPLC-MS/MS進(jìn)行確證,這種方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)包括呋喃西林在內(nèi)的硝基呋喃類代謝物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的篩查。

3 總結(jié)與展望

本文綜述了目前呋喃唑酮及其代謝物的紫外分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)等一系列檢測(cè)方法。不同方法各具特點(diǎn),適用于不同的基質(zhì)和產(chǎn)品。對(duì)于NFZ來(lái)看,快速檢測(cè)技術(shù)是未來(lái)的發(fā)展方向;從SEM檢測(cè)技術(shù)發(fā)展來(lái)看,無(wú)需衍生,靈敏度高、準(zhǔn)確好的確證技術(shù)是未來(lái)的研究重點(diǎn)。同時(shí),近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)在非呋喃西林源的食品中(如蝦蟹類、次氯酸處理的食品等)也出現(xiàn)了SEM的檢出[32],開(kāi)發(fā)適合不同復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)方法,消除假陽(yáng)性,有效區(qū)分自然產(chǎn)生SEM和NFZ代謝產(chǎn)生SEM也是未來(lái)檢測(cè)技術(shù)需要解決的一個(gè)難點(diǎn)。

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Study on the Determ ination M ethods of Nitrofurazone and Its M etabolite Sem icarbazide

ZHANG Xiao-jun1，WANG Jian2，YAN Zhong-yong1，et al
（1.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute，Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316021；2.School of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

Nitrofurazone（NFZ）as one kind of nitrofuran，was once widely used in farming.Due to its carcinogenicity and teratogenicity，it has been prohibited bymany countries in the world.Determination methods of NFZ are very essential as its metabolite can bind the protein to form steady compound.This paper introduced the determinationmethods of NFZ and itsmetabolite according to a variety of literatures for comparisons of their detection limits，scopes of application and other aspects.iaiming to promote the development of determination technologies of NFZ and itsmetabolite.

nitrofurazone；semicarbazide；determination methods

S859.84

A

1008-830X（2014）05-0442-06

2014-06-20

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ13C200004)

張小軍(1982-),男,河南洛陽(yáng)人,博士,研究方向:水產(chǎn)品質(zhì)量安全及標(biāo)準(zhǔn)化.E-mail：xiaojun3627@163.com