響應(yīng)面法優(yōu)化龍牡寧神湯中君臣藥的提取工藝

候深東，曲有樂，聞?wù)槪鯐圆?/p>

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022）

響應(yīng)面法優(yōu)化龍牡寧神湯中君臣藥的提取工藝

候深東，曲有樂，聞?wù)?，王曉?/p>

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022）

以龍牡寧神湯組方為原料,選取影響中藥提取率的五個因素,即料液比、浸泡時間、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)進行單因素試驗,在此基礎(chǔ)上選取三個因素三個水平,以中藥浸膏得率為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面分析,優(yōu)化其君臣藥水提工藝,為工業(yè)化生產(chǎn),開發(fā)新劑型提供理論依據(jù);本研究實際提取率與理論值恰合良好,確定的最佳提取條件:浸泡時間為45 min,料液比為1：15,提取時間為50min,提取溫度為100℃,反復(fù)提取2次,首次提取率為8.15%,操作簡單易行,為中藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

龍牡寧神湯;提取率;響應(yīng)面分析法;工藝優(yōu)化

龍牡寧神湯主治癲狂癥(精神分裂癥),有重鎮(zhèn)養(yǎng)心,安神之功效,歷史悠久,始載見自《浙江中醫(yī)雜志》,方中以生龍骨平肝潛陽為君藥,鎮(zhèn)靜安神,臣藥以生牡礪與龍骨相須為用,以加強滋陰潛陽重鎮(zhèn)的作用,佐以甘麥大棗湯益心氣,養(yǎng)心陰,安神,諸藥配伍,共奏重鎮(zhèn)安神,益氣養(yǎng)心之功[1]。

響應(yīng)面是指響應(yīng)變量η與一組輸入變量(ζ1，ζ2，ζ3...ζk)之間的函數(shù)關(guān)系式:η=f（ζ1，ζ2，ζ3...ζk）。響應(yīng)面分析法[2-3]（response surfacemethodology,RSM）是一種利用合理的試驗設(shè)計方法并通過實驗得到一定數(shù)據(jù),采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法,具有實驗周期段、精密度高、交互作用分析簡單等特點,廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[4-5]。本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化龍牡寧神湯中君臣藥的提取工藝,為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 試約與儀器

試藥:生龍骨、生牡礪、積實、竹茹(所需中藥材均購自于浙江舟山同仁堂藥店)。

儀器:中藥粉碎機(DFY-400,溫嶺市林大機械有限公司)、水浴鍋(HWS12型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、電子天平(BSA323S,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9140A型,上海森信實驗儀器有限公司)、燒杯、培養(yǎng)皿、冷凍干燥機(FD-1E,北京德天佑科技發(fā)展有限公司)、低速離心機(TD5K,長沙東旺實驗儀器有限公司)、EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100,上海愛朗儀器有限公司)。

2 實驗方法、結(jié)果與分析

2.1 中藥浸膏的制備

工藝流程:中藥→清洗→烘干→干燥器冷置→粉碎→按處方量混合→水提法→離心操作→上清液→抽濾→濾液蒸發(fā)濃縮→低溫冷凍→冷凍干燥→中藥浸膏[6]。中藥浸膏得率計算公式:中藥浸膏得率=(浸膏重量/中藥材重量)×100%。中藥處方比例見表1。

表1 中藥處方比例Tab.1 Proportion of Chinese traditionalmedicine prescription

2.2 單因素試驗

為了考察提取過程中各影響因素對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響,本研究分別對溶媒用量、浸泡時間、煎煮時間、提取次數(shù)等參數(shù)進行單因素試驗。根據(jù)試驗結(jié)果,從中選擇3個主要影響提取率的因素用于后續(xù)響應(yīng)面法分析,并大致估計響應(yīng)面設(shè)計實驗的中心試驗點和各因素的取值范圍。

2.2.1 料液比對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響

由圖1可知,當(dāng)溶媒用量從8倍增加到14倍時,中藥浸膏的提取率呈不斷增加趨勢,其原因可能是因為隨著溶劑的增多,溶解出來的中藥成分越多,但溶媒用量從14倍增加到18倍過程中中藥的提取率沒有明顯變化,其原因可能是受藥材中所含成分含量的限制,因此確定的最佳溶媒用量為14倍溶媒。

2.2.2 浸泡時間對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響

圖1 料液比對提取率的影響Fig.1 Effects of ratio ofmaterial towater on extraction rate

從圖2可以看出,隨著浸泡時間的變化,龍牡寧神湯中君臣藥提取率維持在6.80%左右,并沒有明顯的變化,可見浸泡時間不是影響提取率的主要因素,為了讓中藥材充分溶脹在實際提取過程中選擇浸泡45min。

2.2.3 提取時間對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響

從圖3可以看出,煎煮時間對龍牡寧神湯中君臣藥提取率有明顯影響,在煎煮40min前,提取率隨時間的延長不多增高,煎煮40min后,提取率隨提取時間的延長反而減少,究其原因可能是中藥中部分物質(zhì)不斷分解或揮發(fā)所致,因此確定的最佳提取時間為45min。

2.2.4 提取溫度對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響

由圖4可知,隨著提取溫度的不斷升高,組方中藥浸膏的提取率也不斷增加,在100℃左右達到最大值,其原因可能是因為隨著溫度的增高,浸膏組分在水溶液中的擴散速率和溶解度增大有關(guān)。

2.2.5 提取次數(shù)對龍牡寧神湯中君臣藥提取率的影響

由圖5可知,龍牡寧神湯中君臣藥的提取率隨著煎煮次數(shù)的增加,提取率不斷下降,重復(fù)提取3次時,耗費大量能源和時間,其提取率已不足1%,因此最佳提取條件為重復(fù)提取2次。

圖2 浸泡時間對提取率的影響Fig.2 Effects of soaking time on extraction rate

圖3 提取時間對提取率的影響Fig.3 Effects of decoction time on extraction rate

圖4 提取溫度對提取率的影響Fig.4 Effects of temperatures on extraction rate

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.5 Effects of extraction times on extraction rate

2.3 響應(yīng)面分析法實驗設(shè)計

2.3.1 響應(yīng)面試驗因素水平和中心組合實驗設(shè)計

根據(jù)2.2中單因素試驗的實驗結(jié)果,選擇溶媒用量、煎煮時間、提取溫度三個影響因素,設(shè)置三個水平,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗原理[7-8],進行實驗因素及水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計Tab.2 Factors and levels in response surface design

根據(jù)表2確定的因素水平,浸泡45min,提取2次,以中藥浸膏得率（Y）為響應(yīng)值（Response）,借助軟件Design-Expert7.1.6 Trial進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,具體實驗方案及實驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 _Response surface Box-Behnken design and corresponding

由表3可以看出本實驗設(shè)計共需要做17個實驗,其中前12個實驗為析因?qū)嶒?后5個實驗為中心實驗。這17個實驗點包括析因?qū)嶒灪土泓c實驗,其中由3個影響因素所構(gòu)成的三維立體圖形的頂點為析因點,三維圖形的中心區(qū)域為零點,中心試驗要重復(fù)5次,以估計實驗誤差。

2.3.2 實驗結(jié)果的ANOVA分析

表4 回歸模擬方程的ANOVA分析結(jié)果Tab.4 ANOVA analysis of the developedregression equation

2.3.3 響應(yīng)面圖形解析

根據(jù)2.3.2得出的回歸方程,做出3個影響因素之間的響應(yīng)面圖,預(yù)測3個影響因素對中藥浸膏得率的影響,具體見圖6～8。

由圖6～8可以看出,在各影響因素取值范圍內(nèi)存在極大值,既是三維立體圖形的最高點,同時也是平面等值線圖的中心點。從圖6可以看到,在0值以下,隨著料液比和提取時間的不斷提高,中藥浸膏得率不斷增加,其原因可能是因為隨著時間的增加溶解在水中的中藥浸膏不斷增加,但從等高線可以看出料液比和提取時間的交互作用并不明顯。

圖6 水料比X1（g/mL）和提取時間X2（t/min）對浸膏得率（Y/%）影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between ratio ofmaterial to water X1（g/mL）and decoction time X2（min）on extraction rate（Y/%）

由圖7可以看出,中藥浸膏得率隨著水料比和提取溫度的升高二不斷增加,但提取溫度對提取率的影響顯著高于料液比,從平面圖形可以看出兩影響因素之間交互作用明顯,和統(tǒng)計分析結(jié)果相一致。

圖7 水料比X1（g/ml）和提取溫度X3（T/℃）對浸膏得率（Y/%）影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between ratio ofmaterial to water X1（g/m l）and temperatures（T/℃）on extraction rate（Y/%）

由圖8可以看出,提取溫度和提取時間對浸膏得率的影響都很明顯,但兩者的交互作用不是太強,結(jié)合圖6、圖7可以看出3個影響因素中,提取溫度對浸膏得率的影響程度最大,提取時間次之,料液比較前兩者影響較弱。

圖8 提取時間X2（t/min）和提取溫度X3（T/℃）對浸膏得率（Y/%）影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between decoction time X2（t/min）and temperatures（T/℃）on extraction rate（Y/%）

由響應(yīng)面模型可以得出,龍牡寧神湯中君臣藥的最優(yōu)提取工藝條件為:用14.53倍的溶媒,浸泡45 min,在96.57℃條件下提取50.53min,反復(fù)提取2次,第一次提取浸膏得率為7.94%。

為了驗證本實驗得到的最佳工藝條件[11],同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利,以料液比為1：15,提取時間為50min,提取溫度為100℃,做3次平行試驗,得到中藥浸膏平均得率為8.15%,與預(yù)測值相比高了1.38%,說明本研究優(yōu)化的工藝條件可靠。

表5 工藝優(yōu)化后預(yù)測值和實際值Tab.5 Predicted and observed values of optimal formulations（n=3）

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗對影響龍牡寧神湯君臣藥提取率的可能因素進行了分析,在基礎(chǔ)上選擇三個主要因素3個水平,進行了響應(yīng)面優(yōu)化實驗,驗證實驗與理論值相吻合,確定的最終提取工藝條件為:浸泡時間為45 min,料液比為1：15,提取時間為50 min,提取溫度為100℃,反復(fù)提取2次,首次提取率為8.15%,為中藥實際開發(fā)和有效利用奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]李培英.中醫(yī)名方新用[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2008：246.

[2]XU JH，WEIC.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible BaChu mushroom by response surfacemethodology[J].Carbohydrate Polymers，2008，72（1）：67.

[3]KHURIA I，MUKHOPADHYAY S.Response surfacemethodology[J].Wiley Interdisciplinary Reviews：Computational Statistics，2010，2（2）：128.

[4]劉 聽，馬 濤，王 勃，等.響應(yīng)面法優(yōu)化脈沖強光對面包表面細菌的殺菌工藝[J].食品科學(xué)，2014，35（18）.

[5]彭曉霞，路莎莎.響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥研究中的應(yīng)用和發(fā)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（19）：296.

[6]董德云，關(guān) 健，金日顯，等.帶式真空干燥技術(shù)在中藥浸膏干燥過程中的研究和應(yīng)用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：310.

[7]GAN C Y，LATIFF A A.Optimization of the solvent extraction of bioactive compounds from Parkia speciosa pod using response surfacemethodology[J].Food chemistry，2011，124（3）：1 277.

[8]DASGUPTA D，SUMAN SK，PANDEY D，et al.Design and optimization of ethanol production from bagasse pith hydrolysate by a thermotolerant yeast Kluyveromyces sp.IIPE453 using response surfacemethodology[J].SpringerPlus，2013，2（1）：1.

[9]LIN Y S，WANG J，WANG X M，et al.Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum using response surfacemethod[J].Chinese Science Bulletin，2011，56（14）：1 422.

[10]JAIN M，GARG V K，KADIRVELU K.Investigation of Cr（VI）adsorption onto chemically treated Helianthus annuus：Optimization using Response Surface Methodology[J].Bioresource technology，2011，102（2）：600.

[11]胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等.響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（7）：124.

Optim ization of Extraction Technique of the Principal and M inister Drug of Longmu Ningshen Decoction via Response Surface M ethodology(RSM)

HOU Shen-dong，QU You-le，WEN Zheng-shun，et al
(School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，China)

In the present study，Longmu ningshen decoction was used as raw materials，select five factors affecting the herbal extracts rate，namely the ratio ofmaterial to water,soaking time，extraction time，extraction temperature，extraction times，to do single-factor experiments；Then based on the results，select three foremost factors（ratio ofmaterial to water，decoction time and temperature）at three levels to do response surface analysis.The extraction rate was taken as the response value.This study aims to improve the extraction rate and provide a theoretical basis for industrial production and development of new formulations.This experiment is simple，feasible and the predicted and observed values are identical.The obtained optimum extraction parameters are soaking time 45 min，ratio ofmaterial to water 1：15，decoction time 50 min，temperature 100℃，extract 2 times and the first time extraction rate is 8.15%.

Longmu ningshen decoction；extraction rate；response surfacemethodology；processoptimization

R943.1

A

1008-830X（2014）05-0414-06

2014-04-28

候深東(1990-),男,山東陵縣人,碩士研究生,研究方向:海洋藥物開發(fā)與利用.E-mail：houshendong@126.com

曲有樂(1990-),男,教授.E-mail：YouLe1960@163.com