反復正加速度暴露致兔缺血心肌動作電位變化的研究

王蘭，端木魯健，焦琳，柳百梅，孫紅嬌，李玉茜，于心亞，黃叢春，羅慧蘭，王俊華，王建昌

航空航天飛行器尤其是戰(zhàn)斗機會對人體心臟器官產(chǎn)生不利影響，其中以正加速度(+Gz)最為突出[1-2]。多年的航空經(jīng)驗顯示，飛行人員長期飛行之后，心律失常的發(fā)生率偏高。另外，患有冠心病的飛行人員不僅影響心臟泵血功能導致血流動力學障礙，還可引起心臟的電不穩(wěn)定而導致心律失常，甚至惡性心律失常。既往研究表明，加速度會誘發(fā)或加重心律失常[3]，但目前對于發(fā)生機制缺乏相關(guān)的深入研究。本課題主要通過研究正常和缺血心肌在模擬飛行環(huán)境的+Gz暴露條件下的單相動作電位(monophasic action potential，MAP)變化情況，推斷主要心肌細胞離子通道的功能變化。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組 健康、雄性、成年新西蘭大白兔60只，體重2.5～3.5kg，由解放軍總醫(yī)院附屬第一醫(yī)院實驗動物科提供并飼養(yǎng)。將實驗動物隨機分為4組：對照組(A組)、+Gz組(B組)、缺血組(C組)、缺血+加速度組(D組)，每組15只。

1.2 材料及主要儀器 動物離心機(空軍航空醫(yī)學研究所)、小動物呼吸機(上海奧爾科特儀器有限公司)、電生理刺激儀DF-5A型(蘇州東方電子儀器廠)、Medlab4c-501生物信號采集系統(tǒng)MD3000(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)、自制復合電極，手術(shù)器械及醫(yī)用縫線等。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血模型的制備 C、D組制備心肌缺血模型。兔術(shù)前禁食1d，仰臥固定于兔固定架上，3%戊巴比妥30mg/kg耳緣靜脈麻醉后，靜脈推注肝素1000U抗凝。四肢皮膚刺入9號金屬針頭，與生物信號采集處理系統(tǒng)心電圖導線連接，觀察并記錄標準肢體導聯(lián)Ⅱ心電圖。嚴格按無菌操作手術(shù)，逐層切開頸部皮膚行氣管插管，連接動物呼吸機，頻率22～25次/min，潮氣量10ml/kg。沿胸骨左緣第3、4肋處剪斷肋骨，將左側(cè)胸壁向外翻起，剪開心包，充分暴露左心室前壁。于左心耳下2mm處穿“6-0”號絲線，打一活結(jié)逐漸拉緊絲線，造成冠狀動脈前降支心肌缺血。方法是拉線的同時觀察心電圖Ⅱ?qū)?lián)的變化，以出現(xiàn)S-T段壓低、抬高或T波倒置等S-T段和(或)T波的變化證明形成了冠脈狹窄、心肌缺血；調(diào)整線結(jié)的松緊度以達到既形成缺血而又不將血管完全阻斷的目的；然后將絲線打死結(jié)形成血管固定性狹窄?？p合關(guān)閉胸腔送動物房飼養(yǎng)。D組術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素80萬U、2次/d，共3d。

1.3.2 +Gz暴露的實驗方法 B組和D組進行+Gz暴露。使用動物離心機進行+Gz暴露：+Gz組兔置于兔籠中(內(nèi)徑30cm×20cm×15cm)，頭朝向離心機軸心，兔籠固定于離心機上。離心機半徑為2m，由計算機進行加速度程序控制。+Gz組暴露條件：G值增長率約為+0.5Gz/s，逐漸達到目標值+8Gz，于+8Gz每次持續(xù)暴露時間為1min，間隔3min，3次/d，共7d。

1.3.3 單向動作電位的記錄 動物的固定、備皮、開胸暴露心臟方法同制備心肌缺血時的實驗方法。自制接觸電極固定于裝有彈簧裝置的固定架上，一端接觸電極光滑球面與左心室表面接觸，垂直輕放，略施壓力，以彈簧拉伸長度限定電極對心臟組織的統(tǒng)一壓力，電極以不因心臟搏動而移位、心電圖平穩(wěn)為準，另一端與生物信號采集處理系統(tǒng)連接，參考電極夾在胸口皮下組織。生物信號采集處理系統(tǒng)將所測得的信號放大后輸入電腦并觀察記錄。誘發(fā)心律失常方案：將心外膜起搏電極放置于左心室表面，參考電極與皮膚相連進行程序刺激，S1S1刺激頻率從150次/min開始，逐次遞增10次，直至300次/min結(jié)束。

1.4 觀察記錄指標 ①MAP記錄指標(圖1)：復極達50%振幅的單相動作電位時程(MAPD50)；復極達90%振幅的單相動作電位時程(MAPD90)；單相動作電位的振幅(MAPA)；0相最大上升速率(Vmax)。②S1S1刺激時心律失常誘發(fā)率。

圖1 MAP的測量示意圖Fig. 1 Chart of monophasic action potential (MAP)measurement

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0進行分析，所有數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，進一步行多個樣本均數(shù)間的SNK-q檢驗，心律失常發(fā)生率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后兔存活情況 4組中A組無動物死亡，B組中有1只死亡，可能因為加速度暴露引發(fā)心臟疾病；C組有1只在實驗過程中因程序刺激出現(xiàn)室顫而死亡；而D組有2只動物在飼養(yǎng)期間不明原因死亡。

2.2 心肌細胞MAP參數(shù)的變化 結(jié)果顯示，各組間MAPA和Vmax差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與A組比較，B、C、D組MAPD50和MAPD90均明顯縮短(P＜0.05)，且縮短程度呈遞減趨勢(P＜0.05，表1)；心肌缺血后的動作電位時程與缺血前比較明顯縮短(圖2)。

2.3 心律失常誘發(fā)率的比較 結(jié)果顯示，各組心律失常的誘發(fā)情況如下：A組1例；B組6例；C組7例，其中1例因出現(xiàn)室顫而死亡；D組12例，包括室性早搏(圖3A)、室性心動過速(圖3B)等，部分為未行刺激而自發(fā)室性早搏的情況。除C組與B組相比心律失常誘發(fā)率差異無統(tǒng)計學意義外，B、C、D組均較A組容易誘發(fā)，D組又分別較B、C組容易誘發(fā)(P＜0.05)，呈現(xiàn)加速度和缺血雙重因素的疊加效應(yīng)(表2)。

表1 各組MAP的變化情況±s，n=15)Tab.1 Changes of monophasic action potential in each group ( s, n=15)

表1 各組MAP的變化情況±s，n=15)Tab.1 Changes of monophasic action potential in each group ( s, n=15)

A. Control group; B. Acceleration group; C. Ischemia group; D . Ischemia undergoing positive acceleration group. MAPA. Monoph asic action potential amplitude; MAPD 50. Monophasic action potential duration at repolarization of 50% amplitude; MAPD 90. Monophasic action potential duration at repolarization of 90% amplitude; V max. Maximum rising rate of phase 0. (1) P＜0.05 compared with group A; (2) P＜0.05 compared with group B; (3)P＜0.05 compared with group C

Group MAPA (mV) Vmax (mV/s) MAPD50 (ms) MAPD90 (ms)A 32.51±1.49 226.73±4.31 130.44±4.56 139.94±4.30 B 32.30±1.02 225.82±3.80 124.01±3.22 (1) 133.38±3.06 (1)31.72±1.16 224.15±6.77 114.92±3.59 (1)(2) 124.42±3.62 (1)(2)D 31.02±1.35 221.50±6.23 107.96±5.70 (1)(2)(3) 117.33±5.63 (1)(2)(3)C

圖2 心肌缺血后動作電位時程縮短Fig.2 Monophasic action potential shortened after myocardial is chemia

圖3 心律失常的類型Fig.3 Type of arrhythmia

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，+Gz暴露可引起快速性心律失常，同時還可增加缺血心肌發(fā)生快速性心律失常的概率。國外報道指出，符合航空醫(yī)學鑒定標準且無相關(guān)癥狀的身體健康、未曾受過離心機訓練的志愿者，在接受+Gz作用的當時和作用后都會發(fā)生心律失常，發(fā)生概率隨+Gz負荷的增加而升高[4-6]。

從體循環(huán)角度分析其原因，一方面，可能由于在高強度的+Gz作用下，心臟會受到離心力的強烈拉伸、擠壓等形態(tài)變化，誘發(fā)心律失常；另一方面，身體內(nèi)血液會在加速度作用下重新分布，向下半身聚集，造成回心血量大量減少，進而心臟搏出量明顯減少，隨著心輸出量的減少，冠狀動脈的灌注會受到影響，從而造成心肌供血不足誘發(fā)缺血性心律失常；如果同時合并有冠心病，則更容易引發(fā)缺血性心律失常。

表2 心律失常誘發(fā)率Tab.2 Evocation rate of arrhythmia

由于方法學等因素的限制，在公開的文獻庫中很難查到有關(guān)+Gz引起快速性心律失常，以及加重缺血性心律失常的細胞電生理機制方面的報道。經(jīng)典的研究細胞電生理機制、探討離子通道功能的細胞膜片鉗技術(shù)為離體實驗，需要從組織消化、分離心肌細胞，其中影響因素環(huán)節(jié)多，各種藥物、試劑對細胞結(jié)構(gòu)和功能，包括離子通道的影響較大，因此用來研究缺血和加速度對心肌細胞的作用有一定難度和不確定性。鑒于此，筆者通過復習文獻和預實驗摸索，決定采用接觸電極直接記錄心肌細胞群的MAP技術(shù)。該技術(shù)與單個心肌細胞跨膜動作電位(transmembrane action-potential，TAP)具有相同的時限[7]，可實施于完整搏動的心臟上，對組織無損傷，可比較準確地反映缺血心肌細胞的電生理特點，在一定程度上能真實反映心肌細胞的電生理特性。結(jié)果證明我們采用該技術(shù)取得了預期效果。

本研究結(jié)果顯示，重復、長時間+Gz暴露和缺血均可使心肌MAPD50(50%動作電位時程)和MAPD90(90%動作電位時程)縮短，但缺血比+Gz暴露時動作電位的變化程度大，而+Gz暴露和缺血雙重因素疊加作用比單純+Gz暴露或缺血時動作電位的變化程度大。既往研究也得到過與本研究一致的結(jié)果[8]：實驗動物犬冠脈結(jié)扎前后缺血區(qū)心室動作電位時程縮短。

本研究提示，復極過程中相關(guān)離子通道功能異常是加速度引起缺血心肌心律失常的重要機制。以往主要基于缺血心肌的研究提示MAPD90縮短的離子流基礎(chǔ)包括3個方面：①動作電位I期瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)增加。一般情況下，兔的外膜心肌Ito電流密度明顯大于心內(nèi)膜，缺血時Ito通道進一步開放，加速了復極過程。②復極Ⅱ期L型鈣內(nèi)流減少。心肌缺血時，細胞Na+/Ca2+交換能力下降、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從胞質(zhì)攝取的Ca2+減少以及細胞膜Ca2+內(nèi)流增加等因素，導致心肌細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，進而誘導Ca2+電流的滅活。③ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive potassium channel，KATP)開放。發(fā)生心肌缺血時，細胞內(nèi)ATP/ADP的比值下降，導致正常條件下關(guān)閉的鉀通道開放，造成Ⅲ期復極階段外向鉀電流增加，動作電位時程縮短[9-10]。

本實驗結(jié)果顯示，作為損傷因素，+Gz暴露與缺血均使得MAPD90縮短，因此，推測+Gz暴露導致了與上述缺血效應(yīng)相似的離子通道功能變化。

缺血、+Gz或兩者疊加導致的部分區(qū)域心肌細胞MAPD50和MAPD90縮短，造成這部分心肌與正常心肌之間電生理特性的不均一性，引起復極離散程度增加，進而可能造成折返性心律失常，形成心律失常的電生理基礎(chǔ)。

本課題研究結(jié)果顯示，與對照組比較，加速度組和缺血+加速度組的MAPA和Vmax變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。MAPA和Vmax反映的是快鈉通道開放的程度以及Na+內(nèi)流的速度。其他學者研究顯示心肌缺血時MAPA、Vmax降低[11]。本研究顯示缺血動物該兩項指標變化不大，可能是我們在實驗動物造模時使其缺血的程度不如其他研究嚴重，未形成心肌梗死。這與本課題的實驗設(shè)計有關(guān)，本課題的出發(fā)點是模擬并探討患有冠心病、冠脈狹窄但并非急性心肌梗死時期的飛行人員在進行飛行作業(yè)接受加速度暴露時會發(fā)生的問題。而且，動物需要繼續(xù)飼養(yǎng)和接受加速度暴露，如果造成心肌梗死，動物死亡率會較高，無法完成后續(xù)的實驗。也就是說，本研究中導致心律失常的主要原因不是心肌細胞快鈉內(nèi)流異常。

總之，本研究結(jié)果可為進一步研究飛行人員缺血性心律失常的防治提供理論指導。

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