趨化性細(xì)胞因子在腎移植排斥反應(yīng)中的臨床應(yīng)用價(jià)值

肖漓，何秀云，周文強(qiáng)，樊文梅，魏玉香，王新穎，高鈺，馬錫慧，孔祥瑞，韓永，許曉光，黃海燕，石炳毅

1998年Sallusto等[1]報(bào)道，趨化性細(xì)胞因子參與調(diào)控T細(xì)胞的活化及趨化向移植物的遷移過程。因此，趨化性細(xì)胞因子在器官移植領(lǐng)域中的作用受到關(guān)注[2]。本研究關(guān)注兩類5種趨化性細(xì)胞因子。其中一類趨化性細(xì)胞因子的近氨基端存在兩個(gè)相鄰的半胱氨酸(CC)，包括單核趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)和調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)分泌因子(reduced upon activation normal T cell expression and secretion，RNATES)。另一類其近氨基端存在半胱氨酸-其他氨基酸-半胱氨酸(CXC)基序，包括中性粒細(xì)胞激活蛋白-1(neutrophilactivating protein 1，NAP-1/IL-8)、IFN-γ誘生單核因子(monokine induced by interferon-γ，MIG)和IFN-γ誘導(dǎo)蛋白-10(IFN-γ-inducible protein-10，IP-10)。本研究采用流式微球捕獲技術(shù)(CBA)檢測腎移植受者體內(nèi)趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)變化，分析其與臨床及因子間的相關(guān)性，為揭示排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 2011年1－12月間在解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所進(jìn)行同種異體腎移植術(shù)的患者149例，排除并發(fā)任何感染、樣本收集缺失、無腎臟病理結(jié)果等患者，最終納入21例，年齡34.9±7.5歲，其中男15例，女6例，觀察周期為術(shù)前1d至術(shù)后28d，收集樣本135份。原發(fā)病包括IgA腎病、慢性腎小球腎炎、多囊腎等。將21例進(jìn)行同種異體腎移植術(shù)的患者分為急性排斥反應(yīng)(AR)組(n=11)，功能穩(wěn)定組(F組，n=10)，另納入同期在解放軍第309醫(yī)院健康查體的志愿者10例作為對照組(C組)，年齡33.0±6.8歲，其中男5例，女5例，并排除各種原發(fā)性疾病。所有受者均簽訂知情同意書。臨床研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)后依據(jù)常規(guī)使用免疫抑制劑。

1.2 指標(biāo)定義 急性排斥反應(yīng)(AR)：尿量減少，發(fā)熱(體溫可＞38℃)、血壓升高，實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)肌酐和尿素氮升高、肌酐清除率下降、蛋白尿、尿比重下降。尿脫落細(xì)胞檢查發(fā)現(xiàn)集合小管、核殘余細(xì)胞碎片及纖維蛋白原沉著增多。彩超顯示移植腎體積增大、血流減少、皮髓分界模糊、血管阻力增加(R＞0.9)。11例AR均發(fā)生于術(shù)后1個(gè)月內(nèi)，時(shí)間為3～25d，平均為10.5d。移植腎功能穩(wěn)定的判斷依據(jù)：術(shù)后移植腎功能恢復(fù)正常，半年內(nèi)血肌酐維持在103μmol/L以下，24h尿量在1600ml左右，尿比重為1.01～1.04，B超顯示移植腎體積、結(jié)構(gòu)和血流均正常。

1.3 儀器及試劑 美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀。使用CellQuest、BD CBA數(shù)據(jù)分析軟件。細(xì)胞因子檢測試劑盒為BDTM Cytometric Bead Array(CBA) Human chemicokine生產(chǎn)。5種偶合不同熒光強(qiáng)度的微球，這種熒光染料發(fā)射波長約650nm，同時(shí)微球連接5種細(xì)胞因子抗體。

1.4 樣本采集 分別收集研究對象外周血3～5ml，采用EDTA抗凝，時(shí)間點(diǎn)包括術(shù)前1d，術(shù)后1、7、14、28d以及排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)。2500r/min離心10min分離血漿，每例取3管，100μl/管，－80℃保存?zhèn)溆谩颖玖緼R組(n=58)和F組(n=50)共計(jì)108份，檢測時(shí)為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每份樣本平行測量3管，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 CBA檢測步驟 流式微球捕獲技術(shù)檢測血漿中5種細(xì)胞因子為CXCL10/IP-10、CXCL9/MIG、CXCL8/IL-8、CCL2/MCP-1、CCL5/RNATES。標(biāo)本制備：50μl待測血漿首先加入50μl捕獲微球(依據(jù)說明及時(shí)配置捕獲微球混合物)，然后加入50μl檢測抗體(PE標(biāo)記)，室溫避光孵育2h，加入1ml洗液，1500r/min離心5min，洗滌3次，上機(jī)采用CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)品制備：將標(biāo)準(zhǔn)品按照梯度法依次稀釋為5000、2500、1250、625、312.5、156、80、40、20pg/ml及空白對照管，上機(jī)檢測后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。上機(jī)前清洗儀器并分別使用BD CaliBRITE Beads校準(zhǔn)儀器，CBA試劑盒中的Cytometer Setup Beads調(diào)節(jié)電壓、補(bǔ)償?shù)取?/p>

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graph 5.0軟件進(jìn)行分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后5種趨化性細(xì)胞因子表達(dá)含量不符合正態(tài)分布，以M(R)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組間的臨床特征 AR組于AR發(fā)生當(dāng)天檢測肌酐水平，F(xiàn)組于術(shù)后14d檢測，結(jié)果顯示AR組肌酐為305.42±87.13μmoI/L，F(xiàn)組為69.31±11.87μmoI/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩組間其余指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2 趨化性細(xì)胞因子的組間比較 移植術(shù)前，AR組、F組MCP-1表達(dá)含量明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-8在3組的表達(dá)含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AR、F組MIG表達(dá)含量與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。AR、F組IP-10表達(dá)含量與C組比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AR和F組間受者外周血漿中5種趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為確定排斥反應(yīng)影響腎功能時(shí)的細(xì)胞性趨化因子釋放情況，我們檢測移植術(shù)后趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)含量。與C組比較，除F組MIG外，AR組、F組細(xì)胞性趨化因子MCP-1、IL-8、MIG、IP-10均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；且AR組亦明顯高于F組。3組移植術(shù)前、術(shù)后RANTES表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表1 兩組患者臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical features in two groups

表2 移植術(shù)前、術(shù)后各組趨化性細(xì)胞因子的組間比較[M(R)]Tab.2 Comparison of levels of Chemokines in three groups before and after transplantation [M(R)]

2.3 趨化性細(xì)胞因子與肌酐的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，術(shù)前MCP-1、RNATES、IP-10、MIG和IL-8的表達(dá)含量與肌酐水平之間無明顯相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)(r)分別為－0.1487、0.1000、0.1000、－0.7000、－0.3000。術(shù)后IL-8、MIG與肌酐水平呈正相關(guān)性[(r=0.4896、95%CI(0.2423～0.6772)，r=0.6245、95%CI(0.4145～0.7713)，P＜0.01)]。而MCP-1，RNATES、IP-10與肌酐水平無顯著相關(guān)性(P＞0.05，圖1)。

3 討 論

排斥反應(yīng)的發(fā)生過程是移植物抗原經(jīng)受者APC提呈后，初始狀態(tài)的淋巴細(xì)胞活化成為效應(yīng)T細(xì)胞，繼而進(jìn)入抗原存在的移植物組織發(fā)揮免疫效應(yīng)[3]。趨化性細(xì)胞因子是一類對不同靶細(xì)胞具有趨化效應(yīng)的細(xì)胞因子家族，1992年統(tǒng)一命名為chemokine。迄今，已知的趨化性細(xì)胞因子達(dá)50種。根據(jù)半胱氨酸的位置、排列方式和數(shù)量分為4類：CC，CXC，C和CXXXC趨化性細(xì)胞因子?？捎啥喾N細(xì)胞包括單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、血小板等產(chǎn)生，具有激活和趨化白細(xì)胞的作用[4-5]。已發(fā)現(xiàn)趨化性細(xì)胞因子參與T細(xì)胞的分化、遷移、活化及效應(yīng)，它在排斥反應(yīng)中的調(diào)控作用也越來越受到關(guān)注[6]。

本研究采用CBA法[7]以微量樣本同時(shí)檢測5種趨化性細(xì)胞因子，具有靈敏、精確、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)前AR和F組間受者外周血漿中5種趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組MCP-1、MIG、IP-10表達(dá)水平均高于C組(P＜0.05)。腎移植受者術(shù)前腎功能嚴(yán)重?fù)p傷，MCP-1是趨化單核細(xì)胞浸潤和造成腎小管損傷的主要原因，MIG和IP-10通過IFN-γ誘導(dǎo)Th1漂移，從而使腎組織炎癥反應(yīng)加速。有研究總結(jié)腎移植受者術(shù)前IP-10和MIG高水平表達(dá)更易發(fā)生嚴(yán)重的IR，因此提出可作為抗排斥反應(yīng)治療的監(jiān)測指標(biāo)，并且具有早于肌酐的預(yù)測價(jià)值[8]。但其術(shù)前結(jié)果與本研究存在差異，原因可能為腎移植受者存在不同的原發(fā)病，本研究中的受者術(shù)前診斷包括急慢性腎小球腎炎、系膜增生性腎小球腎炎、紅斑狼瘡等腎臟疾病，其中3例為乙型肝炎病毒攜帶者，而其他腎移植受者的原發(fā)病以慢性腎炎為主。為探討術(shù)前趨化性細(xì)胞因子與腎功能的相關(guān)性，分別統(tǒng)計(jì)其與血肌酐的Spearman相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示無相關(guān)性，因此推測趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)水平與其原發(fā)病引起的炎癥反應(yīng)更為相關(guān)，而其與腎移植術(shù)后的轉(zhuǎn)歸及其原發(fā)病的病理分類有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量分析。

圖1 肌酐與MIG(A)、IL-8(B)、MCP-1(C)、IP-10(D)、RNATES(E)表達(dá)含量的相關(guān)性分析Fig.1 Association analysis between serum creatinine (Cr) and the expressions of MIG (A), IL-8(B), MCP-1(C), IP-10(D),RNATES(E)

本研究比較了術(shù)后AR、F組受者外周血漿中趨化性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AR組的MCP-1、IL-8、MIG、IP-10均高于F組。IL-8、MIG和IP-10是CXC類趨化性細(xì)胞因子，其中MIG和IP-10主要介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng)，趨化單核細(xì)胞和T細(xì)胞，可加強(qiáng)Th1反應(yīng)和破壞Th2反應(yīng)的進(jìn)程。有研究報(bào)道MIG、IP-10水平升高與IR相關(guān)[9-10]。值得注意的是，研究結(jié)果中AR組IL-8與F組比較顯著升高(P＜0.01)。IL-8可非特異性趨化和激活中性粒細(xì)胞，參與哮喘、銀屑病和接觸性皮炎等的發(fā)病過程，而其在腎移植受者體內(nèi)的表達(dá)未見報(bào)道。目前已明確地塞米松、CsA、FK506等免疫抑制劑以及IFN-γ、IL-10和IL-4可下調(diào)IL-8的產(chǎn)生[11]。本研究中腎移植受者發(fā)生AR時(shí)，其體內(nèi)IL-8表達(dá)水平顯著升高，提示IL-8參與AR的可能性。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，MIG和IL-8表達(dá)水平與腎移植受者的血肌酐水平呈正相關(guān)，因此MIG和IL-8具有作為補(bǔ)充腎功能監(jiān)測標(biāo)志的應(yīng)用前景。研究報(bào)道MCP-1、RANTES等在發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的移植腎組織中的表達(dá)上升[12-13]，由于本研究檢測的RANTES含量高于CBA方法最高檢測閾值，依據(jù)技術(shù)指南使用MFI反映其表達(dá)含量，結(jié)果顯示AR組RANTES的表達(dá)無顯著升高或降低，這是由于外周血和腎組織局部微環(huán)境存在差異。

綜上，MIG和IL-8的表達(dá)水平具有成為監(jiān)測腎功能的生物標(biāo)志分子的潛在價(jià)值，但仍有待擴(kuò)充樣本量、細(xì)化分組因素進(jìn)一步研究，以為臨床提供更為確切的參考值。同時(shí)CBA方法擴(kuò)展了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍，從細(xì)胞抗原到細(xì)胞外蛋白或細(xì)胞因子的定量檢測，可同時(shí)檢測單一樣本中的多個(gè)目的蛋白，具有微量、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量、檢測靈活等優(yōu)點(diǎn)且范圍寬，值得推廣應(yīng)用。

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