流感病毒裂解疫苗無菌檢查法的建立

北京市藥品檢驗(yàn)所（100035）王似錦 高春

疫苗免疫仍然是當(dāng)今預(yù)防流感最有效的手段。國際標(biāo)準(zhǔn)的流感疫苗證明安全有效[1]。流感疫苗是最早進(jìn)行核酸疫苗研究的一種疫苗[2]。流感病毒裂解疫苗是用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的、并經(jīng)國務(wù)院藥品管理部門批準(zhǔn)的甲型和乙型流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）病毒株分別接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒、病毒活化，純化、裂解后制成[3]。

裂解型流感滅活疫苗是建立在流感全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上，通過選擇適當(dāng)?shù)牧呀鈩┖土呀鈼l件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，經(jīng)過不同的聲場(chǎng)工藝取出裂解劑和純化有效成風(fēng)制備而成。目前使用的裂解劑主要包括乙醚、3-N-丁基磷酸鹽（Tri-N-butyl phosphate）、聚山梨酯80（Polysothat 80）、脫氧膽酸鈉（Sodiumdeoxyholate）及三硝基甲苯X100（TritoX100）等，裂解型流感疫苗可降低全病毒滅活疫苗的接種副反應(yīng)，并保持相對(duì)較高的免疫原性，可擴(kuò)大疫苗的使用范圍，但在制備過程中須添加和去除裂解劑[4]。

中國藥典2010年版三部附錄[5]要求，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法，并要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。流感病毒裂解疫苗含硫柳汞防腐劑，在無菌檢查過程中，該防腐劑的殘留有可能導(dǎo)致加入的驗(yàn)證菌株無法生長，從而導(dǎo)致無菌檢查法的驗(yàn)證失敗[6]。本研究用硫代硫酸鈉作為中和劑，該中和劑能夠成功的消除硫柳汞防腐劑的抑菌作用，從而建立了流感病毒裂解疫苗的無菌檢查法，現(xiàn)將筆者的研究總結(jié)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備 HTY無菌隔離器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；HTY-2000A集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；一次性使用的全封閉三聯(lián)集菌培養(yǎng)器KDGB330（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 樣品 本試驗(yàn)所用樣品為流感病毒裂解疫苗（批號(hào)：20110604，規(guī)格：0.5ml/支），由北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑和培養(yǎng)基 0.1%蛋白胨水溶液、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基均按照中國藥典2010年版三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法項(xiàng)下要求配制及滅菌。0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液：取硫代硫酸鈉26g與無水碳酸鈉0.20g，加新沸過的冷水適量使溶解，并稀釋至1000ml，搖勻，濾過，分裝，滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為30min。

附表 流感病毒裂解疫苗無菌檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

1.4 菌種 本試驗(yàn)所用菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 菌液制備 按照中國藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法項(xiàng)下對(duì)照菌液配置，菌液濃度10～100CFU/ml。

2.2 試驗(yàn)方法 取樣品20支，全部轉(zhuǎn)移至稀釋液（0.1%蛋白胨水溶液或0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液）100ml中，作為供試液；取一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（三聯(lián)），先用沖洗液（0.1%無菌蛋白胨水溶液）潤濕濾膜，將上述供試液全部通過3個(gè)濾器，濾干后用沖洗液沖洗，沖洗1次，每次每膜100ml。過濾后，2個(gè)濾器加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100ml，另1個(gè)濾器加改良馬丁培養(yǎng)基100ml。分別加入6種驗(yàn)證菌株（10～100CFU），硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的濾器置35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置25℃培養(yǎng)，觀察驗(yàn)證菌生長情況。

3 結(jié)果與討論

分別采用2種稀釋液的無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果見附表所示。采用0.1%蛋白胨水溶液作為稀釋液，4種細(xì)菌均生長良好，而加入的白色念珠菌和黑曲霉未生長。采用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為稀釋液，4種細(xì)菌和2種真菌均生長良好。細(xì)菌在使用兩種稀釋液的情況下均能夠生長良好，分析原因可能是硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中含有硫乙醇酸鈉，該鈉鹽能夠中和汞類防腐劑硫柳汞[7]。而白色念珠菌和黑曲霉所用的培養(yǎng)基是改良馬丁培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中沒有能夠中和汞類防腐劑的成分，因此，需要使用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑，以便消除該疫苗樣品中的硫柳汞防腐劑的抑菌作用，從而使白色念珠菌和黑曲霉在培養(yǎng)72h后能夠生長良好。

4 結(jié)論

流感裂解滅活疫苗是在全病毒顆粒疫苗的基礎(chǔ)上，采用適當(dāng)方法將流感病毒顆粒裂解，保留其有效抗原，去除易引起副反應(yīng)的成分。有研究表明，流感病毒表面的HA在流感病毒感染過程中起著重要作用，其抗體是一種保護(hù)性抗體；同時(shí)神經(jīng)氨酸酶抗體具有抑制流感病毒再感染的功能，所以也具有一定的保護(hù)作用；而病毒中的類脂成分和病毒顆粒內(nèi)部的蛋白不但對(duì)抗體產(chǎn)生顯著作用，還易引起接種副反應(yīng)。裂解劑的作用是裂解病毒核酸和大分子蛋白，保留其抗原的有效成分。但裂解劑濃度過高或作用時(shí)間過長均會(huì)使血凝素（HA）發(fā)生斷裂，影響疫苗抗原性，因此裂解劑的選擇及作用條件非常重要。

利用硫代硫酸鈉作為中和劑，能夠消除流感病毒裂解疫苗中所含的硫柳汞防腐劑的抑菌作用，建立該產(chǎn)品的無菌檢查法為：取本品20支，全部轉(zhuǎn)移至0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液100ml中，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1%蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，其余操作依照中國藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。