水蛭粉對高脂血癥大鼠動脈粥樣硬化形成過程的干預(yù)機制

高麗娟，高 娟，胡耀紅，楊 喬

(1.天津西青醫(yī)院，天津 300380;2.濰坊護理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500;3.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070;4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052)

動脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是心血管疾病中最常見的疾病，嚴重危害人類健康［1-2］。動脈粥樣硬化是多病因共同作用的結(jié)果，其病理機制復(fù)雜。目前認為氧化應(yīng)激、炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的核心機制［3-4］?；钚匝?(ROS)是動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的始發(fā)因素，ROS及其氧化修飾低密度脂蛋白形成的氧化型低密度脂蛋白是內(nèi)皮損傷和誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞黏附分子、趨化因子、炎性細胞因子表達的主要原因［5］。因此針對動脈粥樣硬化抗氧化、抗炎治療的臨床與基礎(chǔ)研究成為動脈粥樣硬化預(yù)防與治療用藥的重要評價手段。水蛭為水蛭科動物螞蝗的干燥全體，具有破血逐瘀通經(jīng)的功效。本課題組前期研究表明，水蛭可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、糾正一氧化氮 (NO)代謝紊亂及抑制細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達等環(huán)節(jié)，干預(yù)動脈粥樣硬化的形成［6］。高脂血癥是AS的獨立危險因素之一，可通過誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷損害血管內(nèi)皮細胞代謝和功能等諸多作用，導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展［7］。中藥多具備“多成分，多靶點”的特點，本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上通過觀察水蛭粉對高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激及MCP-1表達的影響，進一步探討其抗動脈粥樣硬化形成的機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，平均體質(zhì)量 (220±20)g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所實驗動物中心，許可證號:SCXK(津)2010—0002。

1.2 藥物及主要試劑 水蛭粉是由水蛭全體經(jīng)烘干，研粉炮制而成 (批號20120601)，由貴州信邦制藥股份有限公司提供;高脂飼料 (配方:82.7%普通飼料、2%膽固醇、0.3%膽鹽、5%蔗糖、10%豬油)和普通飼料由天津?qū)嶒瀯游镏行娘暳蠌S提供;總超氧化物歧化酶、丙二醛和蛋白定量測試盒均購自南京建成生物工程研究所;單核細胞趨化蛋白-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 主要儀器 TU-1810紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，酶標(biāo)儀 (北京普天新橋有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 分組及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將大鼠分為5組，空白對照組，模型對照組，水蛭粉高、中、低 (3.0、1.5、0.3 g/kg)劑量組，每組各10只。除空白對照組外，其余各組均喂高脂飼料，用生理鹽水將水蛭粉配成不同質(zhì)量濃度的混懸液，次日按10 mL/kg開始灌胃給藥，正常對照組和模型對照組灌服等容積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周，并于每周稱體質(zhì)量一次以調(diào)整給藥量。實驗滿8周，最后一次灌胃后，各組動物禁食 (自由飲水)12 h，次日清晨將全部動物稱體質(zhì)量，股動脈取血，然后處死動物，留取標(biāo)本。

2.2 計算肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù) 頸椎脫臼處死動物后，剖開腹腔，取出肝臟，迅速稱質(zhì)量，剝離附睪和腎周脂肪，迅速稱質(zhì)量，計算肝臟指數(shù) (肝臟指數(shù)=肝質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%)和脂肪指數(shù) (脂肪指數(shù)=脂肪質(zhì)量÷體質(zhì)量 ×100%)。

2.3 血清和肝臟的SOD活性和MDA水平測定 股動脈取血，離心取血清備檢，另取肝組織，用冷生理鹽水漂洗，去除血跡，濾紙拭干，稱質(zhì)量，將血管浸入冷生理鹽水(生理鹽水質(zhì)量為血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的組織勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明檢測血清和肝組織勻漿的SOD活性和MDA水平。

2.4 主動脈MCP-1表達量測定 取胸主動脈，用冷生理鹽水漂洗，去除血跡，濾紙拭干，稱質(zhì)量，將血管浸入冷生理鹽水 (生理鹽水質(zhì)量為血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的組織勻漿，離心取上清液。按試劑盒說明用ELSIA法檢測動脈壁MCP-1的表達。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，多組資料組間比較采用單因素方差分析:方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Tamhane’s T2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠血脂的水平 于實驗第4周檢測各組大鼠血脂的水平，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清TC、LDL-C水平均較空白對照組顯著升高，HDL-C水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)，模型對照組大鼠血清TG較空白對照組有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示高脂血癥大鼠造模成功，見表1。

表1 各組大鼠血脂水平 (，n=10)

表1 各組大鼠血脂水平 (，n=10)

注:與空白對照組比較，☆☆P＜0.01

組別 劑量 /(g·kg －1) TC/(mmol·L －1) TG/(mmol·L －1) LDL-C/(mmol·L －1) HDL-C/(mmol·L －1)1.54±0.16 1.31±0.11 0.46±0.05 1.32±0.25模型對照組 － 3.05±0.94☆☆ 1.23±0.90 0.94±0.34☆☆ 0.96±0.25☆☆水蛭低劑量組 0.3 2.67±0.85 0.91±0.21 0.80±0.23 1.17±0.23水蛭中劑量組 1.5 2.62±0.59 0.96±0.25 0.82±0.20 1.19±0.20水蛭高劑量組空白對照組 －3.0 2.60±0.72 1.02±0.22 0.78±0.25 1.20±0.18

3.2 水蛭粉對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響 造模初，各組大鼠體質(zhì)量無差異，隨實驗進程，各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，從造模第2周至實驗?zāi)?，模型對照組大鼠體質(zhì)量明顯高于空白對照組 (P＜0.05)。與模型對照組相比，水蛭粉各劑量組大鼠體質(zhì)量均有不同程度降低，以水蛭粉低劑量組效果最佳，且造模第2周時，水蛭粉低劑量組可顯著降低大鼠體質(zhì)量 (P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量的動態(tài)變化 (，n=10，g)

表2 各組大鼠體質(zhì)量的動態(tài)變化 (，n=10，g)

注:與空白對照組比較，☆P＜0.05;與模型對照組比較，*P＜0.05

組別 劑量/(g·kg－1) 0周 2周 4周 6周 8周空白對照組 － 225.9±14.4 290.0±29.5 332.7±40.8 387.4±42.6 403.7±44.0模型對照組 － 238.1±23.2 322.4±41.0☆ 376.9±57.1☆ 430.3±59.7☆ 438.6±51.6☆水蛭粉低劑量組 0.3 226.4±12.4 296.6±17.1* 358.3±22.0 401.5±21.4 411.1±25.1水蛭粉中劑量組 1.5 231.4±21.0 309.6±26.2 377.1±41.5 423.3±49.5 436.3±61.7水蛭粉高劑量組 3.0 228.7±14.0 315.3±22.3 373.2±30.6 420.9±37.0 434.5±42.1

3.3 水蛭粉對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)的影響模型對照組大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)較空白對照組明顯升高 (P＜0.01)，提示模型對照組大鼠體內(nèi)脂肪沉積增加，且可能有肝組織損傷變化。與模型對照組相比，水蛭粉各劑量組均可顯著降低大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù) (P＜0.05或P＜0.01)，提示水蛭粉可減少體內(nèi)脂肪沉積，且可減輕肝組織損傷。水蛭粉各劑量組之間大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)無顯著差異 (P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)的變化(，n=10，%)

表3 各組大鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)的變化(，n=10，%)

注:與空白對照組比較，☆☆P＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

肝臟指數(shù) 脂肪指數(shù)空白對照組分組 劑量/(g·kg－1)－ 2.40±0.20 2.65±0.48模型對照組 － 3.79±0.25☆☆ 2.92±0.89☆☆水蛭粉低劑量組 0.3 3.27±0.32＊＊ 3.21±0.38*水蛭粉中劑量組 1.5 3.24±0.40＊＊ 3.00±0.65＊＊水蛭粉高劑量組 3.0 3.13±0.21＊＊ 3.18±0.47*

3.4 水蛭粉對高脂血癥大鼠血清SOD活性和MDA水平的影響 與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清SOD活性降低和MDA水平升高 (P＜0.01)，提示體內(nèi)抗氧化能力下降，氧化應(yīng)激增高。與模型對照組相比，水蛭粉各劑量組均可不同程度升高大鼠血清SOD活性和降低MDA水平，其中水蛭粉高劑量組可顯著升高大鼠血清SOD活性 (P＜0.05)，其中水蛭粉中、高劑量組可顯著降低血清MDA水平 (P＜0.01)，提示水蛭粉可改善機體氧化應(yīng)激狀況，以高、中劑量組效果較佳，但無明顯量效關(guān)系，見表4。

表4 各組大鼠血清SOD活性和MDA水平的變化 (，n=10)

表4 各組大鼠血清SOD活性和MDA水平的變化 (，n=10)

注:與空白對照組比較，☆☆P＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

)分組 劑量/(g·kg－1)SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL －1－ 231.86±49.84 16.01±6.33模型對照組 － 171.80±48.32☆☆ 38.25±11.33☆☆水蛭粉低劑量組 0.3 214.63±54.45 23.99±5.42水蛭粉中劑量組 1.5 206.48±37.01 17.34±12.92＊＊水蛭粉高劑量組 3.0 219.79±33.30* 21.88±15.73空白對照組＊＊

3.5 水蛭粉對高脂血癥大鼠肝臟SOD活性和MDA水平的影響 與空白對照組相比，模型對照組大鼠肝臟SOD活性降低 (P＜0.01)和MDA水平升高 (P＜0.05)，提示模型對照組肝臟抗氧化能力下降，氧化應(yīng)激增高。與模型對照組相比，水蛭粉各劑量組均可不同程度升高大鼠肝臟SOD活性和降低MDA水平，其中水蛭粉中劑量組可顯著升高大鼠肝臟SOD活性 (P＜0.05)，水蛭粉低、高劑量組可顯著降低大鼠肝臟MDA水平 (P＜0.05)，提示水蛭粉可改善肝臟氧化應(yīng)激狀況，無明顯量效關(guān)系，見表5。

表5 各組大鼠肝臟SOD活性和MDA水平的變化 (，n=10)

表5 各組大鼠肝臟SOD活性和MDA水平的變化 (，n=10)

注:與空白對照組比較，☆☆P＜0.01，☆P＜0.05;與模型對照組比較，*P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1)SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL －1)－ 78.95±8.22 10.94±4.28模型對照組 － 51.77±7.31☆☆ 20.49±11.03☆水蛭粉低劑量組 0.3 58.42±10.41 11.19±7.46*水蛭粉中劑量組 1.5 68.61±19.38* 12.42±6.64水蛭粉高劑量組 3.0 58.58±14.63 9.00±5.11空白對照組*

3.6 水蛭粉對高脂血癥大鼠主動脈MCP-1表達的影響 模型對照組大鼠主動脈MCP-1的表達較空白對照組明顯增強 (P＜0.05)。與模型對照組相比，水蛭粉各劑量組可不同程度抑制大鼠主動脈MCP-1的表達，其中水蛭粉低劑量組可顯著抑制大鼠主動脈MCP-1的表達 (P＜0.01)，見表6。

表6 各組大鼠主動脈中MCP-1蛋白水平的變化 (x ± s，n=10)

4 討論

血脂異常是動脈粥樣硬化形成的首要危險因素，前期研究表明，水蛭粉可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抑制動脈粥樣硬化形成。而肥胖與血脂異常的發(fā)病率呈正相關(guān)，肥胖是指體內(nèi)脂肪堆積過多和 (或)分布異常、體質(zhì)量增加，是一種以炎性因子升高為標(biāo)志的低度炎癥狀態(tài)。過度肥胖造成大量脂肪堆積，脂肪組織分泌脂肪酸增多，通過血液循環(huán)入肝，導(dǎo)致極低密度脂蛋白膽固醇 (VLDL)、載脂蛋白B(apoB)、甘油三酯 (TG)升高，而脂肪組織本身就能產(chǎn)生白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性脂肪細胞因子，這些因子可直接或間接地通過促炎、血栓形成、免疫系統(tǒng)慢性激活等方式導(dǎo)致AS形成［8］。適度降低體質(zhì)量，不僅能減少脂質(zhì)沉積，改善血脂異常，而且還能抑制炎性脂肪細胞因子的表達，改善動脈粥樣硬化病變的炎癥反應(yīng)，對動脈粥樣硬化的防治有著積極的意義。實驗結(jié)果表明，水蛭粉可不同程度降低大鼠體質(zhì)量，以水蛭粉低劑量組效果最佳，水蛭粉各劑量組均可顯著降低大鼠肝臟指數(shù)、脂肪指數(shù)。提示水蛭粉對內(nèi)臟肥胖型大鼠有一定減肥作用，可減少體內(nèi)脂肪沉積，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善機體代謝紊亂，抑制AS的形成。

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，機體或細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和消除失衡，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而引起的細胞毒性過程［9］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS在血管病變，尤其在AS中扮演重要角色［10］。研究表明，高脂血癥時，動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與機體的脂質(zhì)過氧化所造成的損傷有關(guān)，而低密度脂蛋白本身無致動脈粥樣硬化作用，氧化修飾是低密度脂蛋白參與動脈粥樣硬化形成的先決條件［11］。機體脂質(zhì)代謝失調(diào)會產(chǎn)生大量的氧自由基，具有強烈的引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其水平間接反映細胞受自由基攻擊后的脂質(zhì)過氧化程度。SOD是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，能夠清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基，是保持自由基動態(tài)平衡的超家族蛋白酶，是體內(nèi)氧自由基的特異性清除劑，其活性的高低反映機體抗氧化能力的強弱。實驗結(jié)果表明，水蛭粉各劑量組可不同程度改善機體及肝臟氧化應(yīng)激狀況，其中水蛭粉高、中劑量組抗氧化作用優(yōu)于低劑量組，但無明顯量效關(guān)系。提示水蛭粉可清除過多氧自由基，阻斷由氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用對細胞造成的損害，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，提高機體抗氧化能力，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

AS是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?2］。ROS是動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的始發(fā)因素，ROS及其氧化修飾低密度脂蛋白形成的氧化型低密度脂蛋白可導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達黏附分子、趨化因子、炎性細胞因子。在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，黏附分子和趨化因子對循環(huán)中白細胞黏附、遷移及聚集于動脈內(nèi)膜下起關(guān)鍵作用。ICAM-1是與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的黏附分子之一，其可促進單核細胞、淋巴細胞向內(nèi)皮的黏附及遷移，MCP-1是重要的趨化類炎性因子［13］，其可趨化單核細胞和T淋巴細胞，使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集，促進循環(huán)中白細胞遷移并聚集于動脈內(nèi)膜，共同參與動脈的炎癥過程。前期研究發(fā)現(xiàn)水蛭粉可抑制ICAM-1的表達。實驗結(jié)果表明，水蛭粉可不同程度抑制MCP-1表達，以水蛭粉低劑量組效果最佳。提示水蛭粉可通過抑制黏附分子、趨化因子表達，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激、炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的核心機制，抗氧化和抑制炎癥反應(yīng)是防治動脈粥樣硬化病變的重要措施。本研究表明，水蛭粉可減輕氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化病變的進展。本研究發(fā)現(xiàn)水蛭粉低劑量組減肥、抑制炎癥反應(yīng)的效果優(yōu)于中、高劑量組，水蛭粉中、高劑量組抗氧化作用優(yōu)于低劑量組，因樣本量和實驗時間有限，有關(guān)水蛭粉劑量與療效的關(guān)系尚不能確定。而氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS主要通過氧化修飾及激活信號傳導(dǎo)通路參與動脈粥樣硬化的形成。對于水蛭粉能否通過阻斷ROS激活的信號傳導(dǎo)通路干預(yù)動脈粥樣硬化形成的問題，尚待進一步研究。

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