馬尾松松針總黃酮的閃式提取研究

楊炳川，方應(yīng)權(quán)

(重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，重慶 404020)

馬尾松Pinus massoniana Lamb.為松科Pinaceae植物，是重要的用材樹(shù)種和荒山造林的先鋒樹(shù)種，也是三峽庫(kù)區(qū)的主要造林樹(shù)種之一，占庫(kù)區(qū)森林34%，為改善三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境和土壤質(zhì)量的發(fā)揮了重要作用［1-2］。馬尾松具有很好的藥用價(jià)值，松針、松花粉、松節(jié)、松香和松黃均可入藥［3-4］。馬尾松松針 (pine needle)系馬尾松的針葉，具有祛風(fēng)燥濕、解毒止癢、活血安神等功效［3-5］。松針含有揮發(fā)油、維生素、莽草素、黃酮類(lèi)化合物等活性成分［6-7］，其中黃酮類(lèi)化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、舒張血管、抗病毒、抗菌和抗過(guò)敏等多種藥理活性［8］，具有良好的應(yīng)用前景。

松針總黃酮的提取方法主要有溶劑提取法［6，9］、超聲提取法［10］等，乙醇是常用的提取溶劑。傳統(tǒng)的提取方法不同程度存在溶劑和能量消耗大、提取時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。閃式提取法是近年來(lái)應(yīng)用日漸廣泛的一種中藥提取方法，具有快速高效、節(jié)能降耗等優(yōu)點(diǎn)，可以在瞬間完成有效成分的提取，實(shí)驗(yàn)型閃式提取器約1～2 min即可完成提取，中試型5～10 min完成提取，相比傳統(tǒng)提取方法大大節(jié)約了能耗，從而降低生產(chǎn)成本［11-12］。本研究采用閃式提取法提取馬尾松松針中的總黃酮，以正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，為高效合理地利用三峽庫(kù)區(qū)馬尾松資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

JHBE-50S型中草藥閃式提取器 (實(shí)驗(yàn)型，功率1800 W，西安太康生物科技有限公司);RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠(chǎng));UV760CRT雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本島津);Sartorius BS110S分析天平 (北京賽多利天平有限公司);松針樣品采自長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)鐵峰山，由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為馬尾松的松針;蘆丁對(duì)照品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)110883—200701);所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 閃式提取法提取馬尾松松針總黃酮 取馬尾松松針烘干 (60℃，12 h)，粉碎，制成粗粉 (20目)，精密稱(chēng)取20 g粗粉置閃式提取罐內(nèi)，加入12.5倍量 (250 mL)70%乙醇提取110 s，工作電壓為120 V。提取液0.8 μm粒徑濾膜濾過(guò)，濾液備用。

2.2 總黃酮的定量測(cè)定和提取得率 根據(jù)文獻(xiàn)［13-14］，以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮的量。

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加適量70%乙醇，超聲使溶解，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度約為0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下濾液，加70%乙醇至250 mL，精密吸取2 mL至50 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的對(duì)照品貯備液至10 mL量瓶，根據(jù)文獻(xiàn)方法［13-14］，分別依次加入 0.3 mL 5%HNO2溶液、0.3 mL Al(NO3)3溶液和4 mL 4%NaOH溶液，每加入一種溶液后均須搖勻并靜置6 min，最后加70%乙醇至刻度，制成質(zhì)量濃度在0.01～0.05 mg/mL范圍的系列對(duì)照品溶液 (n=5)，以相應(yīng)溶劑為空白，在510 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度，得回歸方程A=0.9037C+0.0826，r=0.9998。其中A為吸光度，C為對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度。表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度 取1.5 mL對(duì)照品貯備液置10 mL量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下條件操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，其RSD為0.78%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度較好。

2.2.5 重復(fù)性 按“2.2.2”項(xiàng)條件制備供試品溶液6份，精密吸取2.5 mL至10 mL量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下條件顯色，測(cè)定總黃酮含有量，其RSD為1.06%(n=6)，說(shuō)明方法重復(fù)性較好。

2.2.6 回收率 精密稱(chēng)取已知總黃酮量的松針粗粉20 g置閃式提取罐內(nèi)，加入對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下方法提取總黃酮，按“2.2.2”和“2.2.5”項(xiàng)下條件測(cè)定總黃酮的量，重復(fù)操作6次，得總黃酮的回收率為96.27%(n=6)。

2.2.7 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液2.5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下條件操作，分別在 0、20、40、60、90、120 min時(shí)測(cè)定吸光度，RSD為0.76%，說(shuō)明供試品溶液中120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 馬尾松松針提取物總黃酮測(cè)定和提取得率 精密吸取供試品溶液2.5 mL至10 mL量瓶，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算總黃酮量，并計(jì)算提取得率。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.3.1 考察因素和水平 考察了影響閃式提取的工藝參數(shù)，根據(jù)文獻(xiàn)［11，15］和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究確定將松針烘干 (60oC，12h)后制成粗粉 (20目)，以乙醇為提取溶劑，固定工作電壓100V。在此基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為指標(biāo)，考察影響得率的主要因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)、液料比 (B)和提取時(shí)間 (C)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表?？疾扉W提法工藝，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)正交設(shè)計(jì)表各因素和水平的安排(表2)進(jìn)行試驗(yàn)，按“2.1”項(xiàng)下方法提取馬尾松松針總黃酮，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮得率，計(jì)算極差 (R)，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)各因素水平進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由極差分析可見(jiàn) (表2)，影響馬尾松松針總黃酮得率的因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞液料比。方差分析顯示，因素A(乙醇體積分?jǐn)?shù))和C(提取時(shí)間)對(duì)考察指標(biāo)的影響呈統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義 (P＜0.05)，因素B(液料比)影響不顯著。為使得率最大，選取各因素k值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的水平，所以，最佳工藝條件應(yīng)為A3B2C2，即70%乙醇，12.5倍的液料比 (V/m)，閃式提取110 s。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最佳工藝條件提取3份各20 g馬尾松松針粗粉，測(cè)定吸光度，計(jì)算得率。3批供試品的得率分別為3.34%、3.43%和3.32%，平均得率為3.36%，顯示此條件提取得率較高，方法重復(fù)性好。

2.4 松針總黃酮提取方法比較 取同一批馬尾松松針粗粉，以文獻(xiàn)報(bào)道的方法［9-10］，分別用乙醇回流、超聲提取法提取松針總黃酮，每種方法重復(fù)3次，與本研究確定的閃提法相比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 提取方法比較

3 討論

本研究建立了馬尾松松針總黃酮的閃式提取法，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定提取物中總黃酮的量，并計(jì)算得率。以總黃酮得率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，得到最佳工藝條件為:將馬尾松松針烘干后制成粗粉 (20目)，工作電壓100 V，以70%的乙醇為提取溶劑，液料比12.5∶1(V/m)，閃式提取時(shí)間110 s，提取得率為3.36%，方法簡(jiǎn)單可靠，重復(fù)性好。

用同一批馬尾松松針樣品，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［9-10］的方法，采用乙醇回流法和超聲提取法提取總黃酮，測(cè)定并計(jì)算得率，與本研究所建立的閃式提取法相比較。由于文獻(xiàn)中馬尾松松針樣品前處理方法不盡相同，分別采用了陰干、烘干［9］和新鮮松針直接提?。?0］的方法，為方便比較，本研究統(tǒng)一采用烘干 (60℃，12 h)后提取的方法比較各種方法的得率。由表4比較溶劑消耗量，閃式提取法∶乙醇回流法∶超聲提取法為1∶2.9∶0.9，即閃式提取法所需溶劑僅為乙醇回流法的約1/3，降低了溶劑用量，這與超聲提取法大致相當(dāng)。比較提取時(shí)間，閃式提取法∶乙醇回流法∶超聲提取法為1∶300∶30，可見(jiàn)閃式提取法大大縮短了工作時(shí)間，并相應(yīng)的降低了耗電量。從總黃酮的提取得率看，乙醇回流法最高，為3.82%，閃提法和超聲法很接近，分別為3.36%和3.48%。

綜合來(lái)看，閃提法提取馬尾松松針總黃酮最大的優(yōu)勢(shì)在于縮短提取時(shí)間，從而減少能耗;溶劑消耗也少于乙醇回流法，總黃酮得率略低于回流法和超聲提取法。因此，閃式提取法可以作為馬尾松松針總黃酮的一種提取方法。

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