冠心平對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化氧化與抗氧化指標(biāo)的影響

戴海云，李七一，嚴(yán)士海

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210000;2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029)

動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機(jī)體過氧化損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院李七一教授臨床采用益氣養(yǎng)陰、活血化痰法治療冠心病心絞痛收到較好效果［1］。此后根據(jù)益氣養(yǎng)陰、活血化痰法自擬了冠心平方應(yīng)用于臨床。在前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究中提示冠心平能調(diào)節(jié)血脂水平、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善心肌缺血，體外實(shí)驗(yàn)證明冠心平含藥血清能減少細(xì)胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細(xì)胞凋亡率，減輕細(xì)胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達(dá)增加［2］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，觀察了冠心平對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型血清氧化應(yīng)激與抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶 (SOD)、總抗氧化能力 (AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)水平的影響，以進(jìn)一步探討該方作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 冠心平，由江蘇省中醫(yī)院藥劑科制備(批號(hào)110802);阿托伐他汀鈣片，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號(hào):084311K);苯磺酸氨氯地平，由輝瑞制藥有限公司提供 (批號(hào)1105113)。血清T-SOD測(cè)定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號(hào)20120530);血清GSH測(cè)定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號(hào)20120611);血清測(cè)定MDA試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號(hào)20120529);血清T-AOC測(cè)定試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供 (批號(hào)20120607)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量 (20±2)g，雄性，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào):SCXK(京)2006-0008。

1.3 分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，稱定質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組編號(hào)。將60只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為空白組 (普通飼料)、模型組 (高脂飼料)、阿托伐他汀組 (6.67 mg/kg)、苯磺酸氨氯地平組 (1.67 mg/kg)、冠心平低劑量組 (0.75 g/kg)、冠心平高劑量組(1.5 g/kg)。各劑量組采用高脂飼料+藥物干預(yù)模式。

1.4 動(dòng)物模型的建立 購買ApoE-/-小鼠，高脂飼料配料(78%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油配制)喂養(yǎng)12周，采血并做病理以確定模型成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 正常組為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余組為高脂飼料飼養(yǎng)。除正常組與模型組外，冠心平低劑量組、冠心平高劑量組、阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組均高脂飼料喂養(yǎng)12周后，給予相應(yīng)的藥物，正常對(duì)照組、模型組則于12周后給予等量蒸餾水灌胃。冠心平高低劑量組與阿托伐他汀組、苯磺酸氨氯地平組分別將藥物溶解于蒸餾水中灌胃，灌胃容積量按0.1 mL/10 g計(jì)算，每日1次，共1周。每周稱體質(zhì)量1次，記錄體質(zhì)量，末次給藥1 h后，眼眶采血，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。處死動(dòng)物，取主動(dòng)脈血管，液氮保存，備檢測(cè)。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.6.1 分光光度法與elisa法檢測(cè)血清中氧化性指標(biāo)MDA等，抗氧化性指標(biāo)SOD、AOC、GSH的水平，具體根據(jù)試劑說明書操作。

1.6.2 ox-LDL的檢測(cè) 提取血管組織蛋白，蛋白樣品處理后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，染色，封閉，一抗二抗孵育，加發(fā)光液，曝光。保存顯示有目的條帶的膠片，以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用圖象分析儀對(duì)條帶做掃描半定量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS 15.0軟件包，資料數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義，P＜0.01為差異有非常顯著性意義;定量分析主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，使用的Image-Pro Plus軟件4.5(Media Cybernetics公司)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 冠心平對(duì)模型 3個(gè)月小鼠血清 T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的影響 模型組小鼠血清 T-SOD、T-AOC、GSH的水平明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P﹤0.01)。模型組小鼠血清MDA、ox-LDL的水平明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平比模型組明顯升高，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.05，P﹤0.01)。冠心平低劑量與高劑量組大鼠血清MDA、ox-LDL的水平比模型組明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異 (P﹤0.01)。提示:冠心平具有升高ApoE-/-小鼠血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，降低血清MDA、ox-LDL水平的作用。見表1～2。

表1 各組3個(gè)月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

表1 各組3個(gè)月小鼠血清T-SOD、T-AOC、MDA、GSH的水平 (，n=10)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01

組 別 T-SOD/(U·mL－1) T-AOC/(U·mL－1) MDA/(nmol·mL－1) GSH/(mg·L－1)96.68±4.58 2.89±0.6 22.64±5.04 13.28±5.82模型對(duì)照組 85.71±18.48△△ 1.54±0.59△△ 33.09±3.93△△ 5.09±2.07△△阿托伐他汀組 95.35±4.42* 2.21±0.58* 25±4.97＊＊ 10.73±4.08＊＊氨氯地平組 95.56±6.64＊＊ 2.31±0.56＊＊ 23.36±5.05＊＊ 12.06±4.63＊＊冠心平低劑量組 94.1 ±2.41＊＊ 2.09±0.56* 24.27±5.42＊＊ 10.34±4.16＊＊冠心平高劑量組 95.44±4.18＊＊ 2.52±0.76＊＊ 22.09±5.72＊＊ 11.95±5.27正常對(duì)照組＊＊

表2 各組3個(gè)月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

表2 各組3個(gè)月小鼠血清ox-LDL的水平 (，n=8)

注:與正常組比較，△△P﹤0.01;與模型組比較，＊＊P﹤0.01

組 別 劑量/(g·kg－1) ox-LDL(μg/mL)1.24±0.44模型對(duì)照組 等量生理鹽水 5.71±1.27△△阿托伐他汀組 6.67×10－3 3.19±1.19＊＊氨氯地平組 1.67×10－3 4.13±0.72＊＊冠心平低劑量組 0.75 5.56±0.93冠心平高劑量組 1.5 2.88±1.12正常對(duì)照組 等量生理鹽水＊＊

2.2 冠心平對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈病理的影響 取主動(dòng)脈血管用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)病理檢查。HE染色，見圖1～2。

HE染色顯示，正常組血管壁內(nèi)膜清晰，無斑塊;模型組斑塊嚴(yán)重;冠心平組結(jié)果與阿托伐他汀組、氨氯地平組的斑塊明顯變小。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中占首位。機(jī)體過氧化損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。正常情況下，隨著氧化代謝效率的提高，體內(nèi)的抗氧化能力也不斷增強(qiáng)，人體已經(jīng)形成較為完善的抗氧化體系，即機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)在某些因素的作用下這種平衡被打破，就形成了氧化應(yīng)激。活性氧在血管病變，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色。氧化應(yīng)激主要通過調(diào)節(jié)過氧化作用、誘導(dǎo)血管炎癥基因表達(dá)、促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，多方面參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

圖1 冠心平對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈病理影響

圖2 主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病

人體內(nèi)SOD以CuZnSOD為主，其含有量最高，是人體細(xì)胞抵御氧自由基損害的重要酶。研究證實(shí)，氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷參與了動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的病理過程［3］，氧自由基不僅氧化修飾低密度脂蛋白，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，而且還可以破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其功能障礙，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。SOD是預(yù)防機(jī)體形成超氧陰離子自由基損害的主要活性酶，SOD活力增高，可對(duì)自由基清除增加，從而減輕對(duì)組織的氧化損傷和抑制LDL的氧化。血清中的T-AOC主要是血清中非酶促體系的抗氧化物質(zhì)和酶促體系少數(shù)小分子量抗氧化物質(zhì)的總和，是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)之一［4］。研究發(fā)現(xiàn)MDA、T-AOC是自由基損傷和酶促、非酶促系統(tǒng)清除氧自由基作用的敏感指標(biāo)［5］。GSH是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種生物活性肽，是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，對(duì)過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［6］。MDA是脂質(zhì)過氧化代謝的毒性終產(chǎn)物，其含量直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度，并可間接反映機(jī)體清除自由基的能力，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性［7］。ox-LDL促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成及進(jìn)展的機(jī)制也非常復(fù)雜，例如:ox-LDL作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)ox-LDL，增強(qiáng)其攝取ox-LDL的功能，并可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1等炎癥遞質(zhì)［8］。血漿中低密度脂蛋白(LDL)和自由基代謝產(chǎn)物丙二醛 (MDA)在過氧化作用下，形成氧化修飾的低密度脂蛋白 (OX-LDL)及MDALDL，OX-LDL和MDA-LDL目前被認(rèn)為是引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集和泡沫形成的重要因素［9-11］。

冠心平由黃精、當(dāng)歸、三七、瓜蔞皮、甘松組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰通絡(luò)、行氣止痛之功效。本方源自古方當(dāng)歸補(bǔ)血湯(《蘭室秘藏》)加減。方中黃精與黃芪既補(bǔ)中益氣，又益精氣，潤心肺，補(bǔ)肝陰，為君藥;當(dāng)歸養(yǎng)血活血、補(bǔ)中有行、補(bǔ)而不滯，三七活血化瘀通脈，兩味共為臣藥;瓜蔞皮寬胸化痰、開痹散結(jié)，為佐藥;甘松理氣止痛，與三七同入心經(jīng)，可治“卒心腹痛滿”，同為使藥。全方藥物性味平和，攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本兼顧，補(bǔ)而不滯，攻而不峻，藥有側(cè)重，甚切冠心病氣陰兩虛、痰瘀互阻之病機(jī)。前期臨床研究冠心平能調(diào)節(jié)血脂水平、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善心肌缺血，體外實(shí)驗(yàn)證明冠心平含藥血清能減少細(xì)胞上清液中ET、MDA的水平，增加超氧化物歧化酶 (SOD)與一氧化氮合酶 (NOS)的活性，減低細(xì)胞凋亡率，減輕細(xì)胞線粒體膜電位的增加，降低NF-κB的表達(dá)增加?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精、三七、甘松、當(dāng)歸均具有抗氧化作用［12-14］。

本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)冠心平對(duì)高脂飼料飼喂致動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠，具有升高血清T-SOD、T-AOC、GSH的水平，和降低血清MDA、ox-LDL水平的作用，證實(shí)其確實(shí)能夠有效地干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展，降低心血管疾病的發(fā)生，為冠心平治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］李七一，張洪兵.冠心平治療冠心病心絞痛56例分析［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21(10):1752-1753.

［2］嚴(yán)士海，李七一，王海丹，等.冠心平片含藥血清對(duì)H2O2誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及NF-κB蛋白表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(9):1267-1271.

［3］孫 愛，朱惠蓮.超氧化物歧化酶抗氧化損傷與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系研究進(jìn)展［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2008，35(5):303-306，309.

［4］金開山，傅春琳，劉春興，等.還原型谷胱甘肽對(duì)高齡2型糖尿病患者抗氧化能力的影響及應(yīng)用的安全性［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31(24):4765-4767.

［5］Nomi Y，Aizawa H，Kurata T，et al.Glutathione reacts with glyoxal at the N-terminal［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(11):2408-2411.

［6］Nair N，Bedwa l S，Prasad S，et al.Short-term zinc deficiency in diet induces increased oxidative stress in testes and epididymis of rats［J］.Indian J Exp Biol，2005，43(9):786-791.

［7］胡 珂，晏新民，胡志雄，等.關(guān)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激方面指標(biāo)的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7(25):9-10.

［8］Zhang W Z，Venardos K，F(xiàn)inch S，et al.Detrimental effect of oxidized LDL on endothelial arginine metabolism and transportation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(5):920-928.

［9］Penn M S，Chisolm G M.Oxidized lipoprote in altered cell function and atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，1994，108(suppl):S21-S29.

［10］楊永宗，阮長耿，唐朝樞.動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病基礎(chǔ)與臨床［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:56-57.

［11］梁引庫，吳三橋，徐仲陽，等.黃精多糖肽的單糖組成和抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(9):94-98.

［12］張玉軍.三七總皂苷的藥理研究進(jìn)展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2009，31(4):589-591.

［13］張?zhí)K陽，蔣開年，王 煜，等.甘松多糖的體外抗氧化性研究［J］.華西藥學(xué)雜志［J］.2009，24(2):145-146.

［14］張先平，王乾興，陳 斌，等.當(dāng)歸多糖抑制氧化損傷延緩造血肝細(xì)胞衰老［J］.中國中藥雜志，2013，28(3):407-411.