HPLC-MS-MS法測(cè)定降糖類中成藥中非法添加物格列波脲

申國(guó)華，董培智，裴社強(qiáng)，郭景文，行江水(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030001)

近年來，一些不法廠商在利益的驅(qū)動(dòng)下，為了增強(qiáng)降糖效果，在降糖類中成藥中非法添加各種降糖類化學(xué)藥物［1］。因此，嚴(yán)厲打擊中成藥中非法添加化學(xué)藥品的不法行為，建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法尤為重要。但造假者的手段越來越隱蔽，甚至添加國(guó)內(nèi)未上市的化學(xué)藥物如格列波脲。格列波脲為磺脲類降糖藥，它與甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲、格列喹酮等又稱為“磺脲類促胰島素分泌劑”，它們有共同的降糖作用機(jī)理，即與胰腺β細(xì)胞膜上的磺酰脲受體結(jié)合，從而啟動(dòng)胰島素的分泌來達(dá)到降糖的目的，它們的降糖優(yōu)點(diǎn)各異，但毒副作用都差不多，僅僅是程度的不同而已;另一方面在結(jié)構(gòu)上它們都以苯磺酰脲為主要官能團(tuán)，其中格列波脲與其他幾個(gè)格列類藥物的區(qū)別在于它們各自所包含的基團(tuán)不同，甲苯磺丁脲包含的是比較簡(jiǎn)單的丁胺，格列齊特包含的是環(huán)戊烷并吡咯烷的基團(tuán)，格列吡嗪所包含的是甲基吡嗪酰胺和環(huán)己烷的兩個(gè)基團(tuán)，格列本脲所包含的是環(huán)己烷和2-甲氧基-5-氯本甲酰胺的兩個(gè)基團(tuán)，格列美脲包含的是對(duì)甲基環(huán)己烷和吡咯烷酮兩個(gè)基團(tuán)，格列喹酮包含的是環(huán)己烷和一個(gè)含異喹啉酮的基團(tuán)，而格列波脲所包含主要是一個(gè)帶四個(gè)手性分子橋環(huán)化合物，而其他幾個(gè)藥物很少含有手性結(jié)構(gòu)。另一類降糖藥是含芐基噻唑烷二酮類藥品，主要代表為馬來酸羅格列酮，鹽酸吡格列酮等。

雖然本品未在國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市，但在實(shí)際工作中已發(fā)現(xiàn)開始有不法分子添加此化學(xué)藥品，但國(guó)家現(xiàn)行的降糖類非法添加化學(xué)藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目不能檢出此藥品，而且國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)此藥品的檢測(cè)方法的報(bào)道［2-22］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了用于降糖類中成藥中格列波脲初篩、定量和確證的方法。

1 儀器與試藥

戴安U3000高效液相色譜儀，AL204-IC電子天平，Thermo LTQ-XL液質(zhì)聯(lián)用儀、ESI離子源;Agilent Eclipse Plus C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);Dikma Spursil C18(150 mm × 2.1 mm，3 μm)柱;甲醇為色譜純 (Dikma公司)，水為純化水，其余試劑均為分析純;格列波脲 (Glibornuride)，批號(hào)1113-082B1，純度86.5%，購(gòu)自加拿大TLCpharmachem公司;所用供試品為舉報(bào)樣品以及市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買樣品。

2 檢測(cè)條件

2.1 液質(zhì)聯(lián)用色譜條件 Dikma Spursil C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3 μm)柱;流動(dòng)相為甲醇(A)-0.01 mol/L乙酸銨溶液 (B)，梯度洗脫(0～10 min，5% ～95%A;10～11 min，95% ～5%A;11～20 min，5%A);柱溫30℃;體積流量0.2 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜配有電噴霧離子源 (ESI)，質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù):ESI+掃描，干燥氣溫度320℃，鞘氣體積流量8L/min，輔助氣體積流量3.3 L/min，噴霧電壓4.5 kV，碰撞能量35 cid。掃描方式:一級(jí)質(zhì)譜全掃描、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍為100～1000 m/z。

2.3 液相定量條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.01 mol/L乙酸銨溶液 (B)，梯度洗脫(0～3 min，40%A;3.1～10 min，40% ～60%A;10.1～30 min，60%A;30.1～40 min，60% ～80%A;40.1 ～60 min，80%A;60.1 ～61min，80% ～40%A;61.1～80 min，40%A);柱溫30℃;體積流量1 mL/min;二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)范圍190～400 nm;進(jìn)樣體積10 μL;理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

3 方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的格列波脲對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

3.2.1 固體制劑 取相當(dāng)于一次口服劑量的供試品 (大蜜丸剪碎可加入適量硅藻土研磨)，研細(xì)混勻，加三氯甲烷 20 mL，超聲處理 (250 W，33 kHz)10 min，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，水浴低溫蒸干，殘?jiān)眉状级哭D(zhuǎn)移至5 mL中，用甲醇定容，搖勻，即得。

3.2.2 液體制劑 取樣品混勻，精密量取相當(dāng)于一次口服劑量的供試品溶液，置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，水浴低溫蒸干，殘?jiān)眉状级哭D(zhuǎn)移至5 mL中，用甲醇定容，搖勻，即得。若樣品溶液質(zhì)量濃度過大，則應(yīng)將其稀釋至線性關(guān)系內(nèi)質(zhì)量濃度。

3.3 對(duì)照品及供試品溶液的色譜及對(duì)應(yīng)紫外光譜結(jié)果。見圖1、圖2。

3.4 格列波脲的HPLC/MS/MS特征離子峰及質(zhì)譜圖 格列波脲對(duì)照品 ［M+H+］m/z如下，一級(jí)質(zhì)譜母離子為367;二級(jí)質(zhì)譜分子離子碎片為349、170、196、152。見圖3。

3.5 線性關(guān)系 精密量取“3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別稀釋成從0.002 mg/mL至0.2 mg/mL范圍內(nèi)的梯度對(duì)照品溶液，測(cè)定色譜峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，積分面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程Y=217.88X+0.3245，r2=0.9998，可見在0.002～0.2 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

圖1 格列波脲對(duì)照品色譜及對(duì)應(yīng)紫外光譜圖Fig.1 Reference Glibornuride chromatograms and the corresponding UV spectra

圖2 供試品中格列波脲色譜及對(duì)應(yīng)紫外光譜圖Fig.2 Glibornuride chromatograms and ultraviolet spectrum of products in the corresponding

圖3 格列波脲質(zhì)譜圖Fig.3 Glibornuride mass spectra

3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一格列波脲對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為0.7%，表明儀器精密度良好。

3.7 定量限及檢出限 以信噪比3倍的為檢出限最低響應(yīng)值，計(jì)算檢出限為15.2 μg/g;以信噪比10倍的為定量限最低響應(yīng)值，計(jì)算定量限為39.3 μg/g。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在制備后每隔2 h進(jìn)一次樣，結(jié)果表明供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法測(cè)定，精密稱取上述已知含有量陽(yáng)性樣品 (消渴丸)9份，分別加入相當(dāng)于線性范圍內(nèi) (使最終的加樣回收溶液中格列波脲的質(zhì)量濃度在0.002～0.2 mg/mL線性范圍內(nèi))3個(gè)不同量的對(duì)照品，按“3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，計(jì)算回收率，平均回收率為96.3%，RSD為1.0%。

3.10 耐用性試驗(yàn) 用兩個(gè)品牌的液相 (戴安及島津)以及兩種品牌色譜柱 (安捷倫和Dikma)對(duì)測(cè)定結(jié)果均不影響，陽(yáng)性樣品及陰性樣品檢出結(jié)果一致。

3.11 專屬性試驗(yàn) 在1批檢出格列波脲的中成藥樣品中按照“2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定，樣品中出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，DAD光譜譜圖均與相應(yīng)的對(duì)照品一致，同條件下其余9種對(duì)照品有效分離，陰性樣品沒有干擾。見圖4、圖5。

圖4 格列波脲與9種對(duì)照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of glibornuride and nine reference substances

圖5 陰性樣品溶液色譜圖Fig.5 Negative sample solution chromatogram

4 樣品測(cè)定

按照所驗(yàn)證的方法對(duì)30多批次降糖類中成藥(劑型包括膠囊、丸、口服液、片劑、顆粒劑)進(jìn)行非法添加降糖類化學(xué)藥品的快速篩查及確證定量，篩選出2批次陽(yáng)性樣品，含有量分別為5.8、3.5 mg/g。

5 討論

5.1 本方法是在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件 (批準(zhǔn)件編號(hào):2009029)檢測(cè)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣可以在同一色譜系統(tǒng)條件下將10種化學(xué)藥品成分進(jìn)行有效分離，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)定為235 nm，而非其最大吸收波長(zhǎng)228 nm，是基于該方法通用的檢測(cè)波長(zhǎng)，可以提高分析效率;該方法中未將液體制劑的制備方法列入其中，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)液體制劑的制備進(jìn)行了補(bǔ)充完善;在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，分別進(jìn)行了ESI+、ESI－的方法考察，但 ESI－結(jié)果不佳，而ESI+結(jié)果則滿意;通過研究證明，該方法準(zhǔn)確可靠，能快速地對(duì)其進(jìn)行篩查、定量測(cè)定及確證，為降糖藥中非法添加化學(xué)藥品又提供了一有力的技術(shù)支持。

5.2 本實(shí)驗(yàn)中涉及的中成藥中非法添加化學(xué)藥品格列波脲是“打非”過程中用“異常圖譜法”意外發(fā)現(xiàn)，說明有些不法廠商對(duì)國(guó)家各類中成藥中非法添加化學(xué)藥品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)非常了解，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中的漏洞，添加一些檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中未列入的化學(xué)藥品，即使檢出也無判定依據(jù)，逃避監(jiān)管。另一方面，因目前我國(guó)尚未批準(zhǔn)格列波脲原料及相關(guān)制劑，但在市場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)此化學(xué)藥品的添加，說明有不法分子在非法合成此原料用于非法添加，有關(guān)部門正在積極查處。

5.3 本實(shí)驗(yàn)所用格列波脲對(duì)照品是從加拿大購(gòu)進(jìn)，國(guó)內(nèi)尚無此對(duì)照，目前我們正努力實(shí)現(xiàn)格列波脲對(duì)照品的自給。

［1］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.2009029，降糖類中成藥中非法添加化學(xué)藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法［S］.2009.

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