精制胃樂膠囊促進(jìn)大鼠乙酸性胃潰瘍修復(fù)的作用與機(jī)制

王雨波 ，余麗梅，姚觀平，陳文明，吳 芹

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563002;2.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563002;3.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貴州遵義 563003)

目前胃潰瘍的治療策略主要包括減小胃黏膜損害性因素的作用，同時(shí)采用抗幽門螺旋桿菌感染藥物和促進(jìn)黏膜修復(fù)藥物進(jìn)行治療［1-2］。

胃樂散由白芍、蒼術(shù)、元胡、肉桂等六味中藥組成，民間用于治療胃脘痛，胃炎、十二指腸潰瘍等病癥治療。藥理學(xué)研究表明，胃樂散對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍具有較好的治療作用，并可抑制胃酸分泌，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫功能［3-5］，組方中藥的多種活性成分還具有舒張血管、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)等作用［6-7］。精制胃樂膠囊是以胃樂散原方，采用現(xiàn)代藥物制劑工藝精制而成。本實(shí)驗(yàn)主要研究精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍的治療作用，并分析可能涉及的胃潰瘍修復(fù)機(jī)制，為該藥的臨床試驗(yàn)研究提供重要的臨床前基礎(chǔ)研究資料。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí) (Ⅱ級(jí))，合格證號(hào):SCXK(遼)2007-0005。

1.2 藥品和試劑 精制胃樂膠囊按胃樂散原方精制，由貴州省遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室與貴陽春科藥物研發(fā)股份有限公司聯(lián)合研制、提供。雷尼替丁為四川省通園制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)090501(國藥準(zhǔn)字H51022156)。6-酮-前列腺素 (6-Keto-PGF 1α)試劑盒由解放軍總院生物工程研究所提供，批號(hào) 20100521;兔抗大鼠表皮生長因子 (epidermal growth factor，EGF)抗體由武漢博士德有限公司提供，批號(hào) 20100225;SP-9000免疫組化染色試劑盒由北京中衫金橋有限公司提供，批號(hào) 20100303;100%冰乙酸為沈陽化學(xué)試劑廠提供，批號(hào)20080703。

1.3 儀器 3K30型高速冷凍離心機(jī) (德國Sigma公司)，Leica光學(xué)顯微鏡 (德國Leica Microsystems公司);GC-2010-γ放射免疫計(jì)數(shù)器 (科大創(chuàng)新股份有限公司中加公司)。

2 方法

2.1 乙酸性胃潰瘍模型制備［8-9］SD大鼠48只，禁食、不禁水24 h，隨機(jī)分出8只作正常對(duì)照組，另40只大鼠，乙醚麻醉剖腹，暴露胃體，用內(nèi)徑6 mm，長2 cm的玻璃管固定于胃體漿膜面，并于管內(nèi)注入0.1 mL乙酸，1 min后即用棉簽沾去乙酸，生理鹽水棉球清洗，將胃還納于腹腔內(nèi)，逐層縫合腹壁。胃潰瘍模型大鼠隨機(jī)分為5組:模型組、雷尼替丁 (30 mg/kg)、精制胃樂膠囊低、中、高各劑量組 (75，150，300 mg/kg)。造模后第2天開始灌胃給藥，每天9點(diǎn)、17點(diǎn)各給藥1次，正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

2.2 取血和病理組織學(xué)檢查 連續(xù)給藥12 d后，禁食24 h處死大鼠，腹主動(dòng)脈取抗凝血4～6 mL，3500 r/min，離心10 min，留取上清液，－20℃保存待用。剖腹取胃，沿潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心，切取含潰瘍邊緣3 mm左右的胃組織 (約1.0 cm×1.2 cm)，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察胃壁組織變化情況。石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，兔抗大鼠EGF抗體 (比例1∶50)和羊抗兔IgG孵育，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，觀察EGF蛋白表達(dá)情況，胃黏膜組織中細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為EGF陽性表達(dá)細(xì)胞。

2.3 潰瘍面積和潰瘍指數(shù) (ulcer index，UI)［10］將胃黏膜展平開，用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍的最大長徑和垂直的最大寬徑，以兩者的乘積作為UI，并計(jì)算潰瘍抑制率，潰瘍抑制率 (%)=(模型組 UI－給藥組 UI)/模型組UI×100%。

2.4 6-Keto-PGF 1α測(cè)定 取留存的血漿，按照6-Keto-PGF 1α試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用放免法，用GC-2010-γ放射免疫計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算血漿6-Keto-PGF 1α的量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 精制胃樂膠囊對(duì)潰瘍指數(shù)的影響 與模型組比較，低、中、高劑量精制胃樂膠囊和雷尼替丁治療12 d后，均能明顯降低乙酸性胃潰瘍大鼠的胃潰瘍面積和UI(P＜0.05和P＜0.01)，潰瘍抑制率可達(dá)31.33% ～50.38%(見表1)。

表1 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠潰瘍指數(shù)的影響(n=8，)

表1 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠潰瘍指數(shù)的影響(n=8，)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg－1) 潰瘍指數(shù)/mm2 潰瘍抑制率/%模型 等量蒸餾水 3.99±0.91—雷尼替丁 30 2.06±1.27＊＊ 48.37精制胃樂膠囊 75 2.74±1.30* 31.33150 1.98 ±0.60＊＊ 50.38300 2.40 ±1.06＊＊39.85

4.2 胃組織大體標(biāo)本觀察 肉眼可見模型組大鼠潰瘍部位的胃漿膜面多有大網(wǎng)膜包裹，部分胃漿膜面與大網(wǎng)膜及周圍肝臟等組織一定程度黏連，胃潰瘍面較深，表面粗糙，潰瘍周圍胃壁有明顯皺縮和缺損;精制胃樂膠囊組和雷尼替丁組胃漿膜也有大網(wǎng)膜包裹，但周圍組織黏連較少，胃潰瘍面積明顯縮小，潰瘍損傷處表面較為光滑，尤其是精制胃樂膠囊中、高劑量組和雷尼替丁組新生的黏膜基本與周圍正常黏膜面長平，胃黏膜表面與正常對(duì)照組十分接近(見圖1)。

圖1 乙酸性潰瘍大鼠胃大體解剖標(biāo)本 (箭頭所示為潰瘍或乙酸涂抹位置)

4.3 大鼠胃黏膜的病理組織學(xué)變化 病理切片鏡下觀察:模型組潰瘍明顯，各層細(xì)胞均排列紊亂，黏膜層較薄，部分區(qū)域黏膜缺損，黏膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤，表面炎性滲出、壞死，較多缺損直達(dá)肌層，黏膜損傷修復(fù)不明顯。各劑量精制胃樂膠囊組和雷尼替丁組潰瘍已不明顯或潰瘍明顯變淺，各層細(xì)胞排列有序，黏膜層較厚，炎性細(xì)胞明顯較少，黏膜損傷修復(fù)明顯 (見圖2)。

圖2 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠胃黏膜病理組織學(xué)變化的影響 (HE，×50)

4.4 精制胃樂膠囊對(duì)大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞EGF表達(dá)的影響 免疫組化染色結(jié)果如圖3所示，胃黏膜層 EGF主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞，模型組黏膜層盡管有大量表達(dá)EGF的陽性細(xì)胞，但總體著色較淺，為弱陽性表達(dá);雷尼替丁組和中、高劑量精制胃樂膠囊組黏膜層不但有大量表達(dá)EGF的陽性細(xì)胞，且著色明顯較深，EGF陽性表達(dá)為強(qiáng)陽性，顯示精制胃樂膠囊可提高潰瘍愈合時(shí)胃黏膜EGF的蛋白表達(dá)水平。

圖3 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性潰瘍大鼠胃黏膜組織EGF蛋白表達(dá)的影響 (×50，免疫組織化學(xué)染色)

4.5 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α量的影響 放免法測(cè)定結(jié)果顯示，與模型組比較，精制胃樂膠囊實(shí)驗(yàn)組血漿中6-Keto-PGF 1α水平僅有增加趨勢(shì)，但無明顯差異 (P﹥0.05，見表2)。

表2 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α水平的影響 (n=5，)

表2 精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α水平的影響 (n=5，)

組別 劑量/(mg·kg－1)6-Keto-PGF 1α/(pg·mL－1)模型 等量蒸餾水329.72±111.28雷尼替丁 30 439.88±150.38精制胃樂膠囊 75 553.40±322.94150 464.09±198.59300 435.85±164.67

5 討論

乙酸性潰瘍主要是由于乙酸損傷局部組織，破壞胃黏膜、黏液-碳酸氫鹽屏障等防御因素，引起微循環(huán)受損所致，其相當(dāng)于人類慢性胃潰瘍，在潰瘍外形、組織學(xué)、愈合和復(fù)發(fā)過程上均類似人類胃潰瘍，是較為常用的胃潰瘍模型。精制胃樂膠囊治療12 d后，給予精制胃樂膠囊能顯著降低乙酸性潰瘍大鼠的UI，各劑量組潰瘍面減少、變淺，炎細(xì)胞少，修復(fù)明顯，表明精制胃樂膠囊對(duì)乙酸性胃潰瘍具有明顯治療作用，也提示精制胃樂膠囊可能在促進(jìn)潰瘍修復(fù)方面也具有重要作用，進(jìn)而我們進(jìn)一步測(cè)定了血漿6-Keto-PGF 1α的量和乙酸性胃潰瘍組織EGF的表達(dá)情況。

前列腺素E(prostaglandin，PG)等是公認(rèn)的胃黏膜防御修復(fù)因子，PG在人類合成的主要是PGE2，在大鼠則為PGI2，由于PGI2生物半衰期僅2～3 min，很快變成穩(wěn)定的6-Keto-PGF 1α，故測(cè)6-Keto-PGF 1α的量能反映血漿PGI2的水平［11］。本實(shí)驗(yàn)大鼠血漿中6-Keto-PGF 1α量與模型組比較僅有增加趨勢(shì)，但無明顯差異，提示精制胃樂膠囊對(duì)血漿中6-Keto-PGF 1α量沒有影響，精制胃樂膠囊可能不影響PG水平。

EGF是一種具有抑制胃酸分泌、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，組織修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)作用的內(nèi)源性物質(zhì)，在保護(hù)胃黏膜免受損傷因子破壞、維持胃黏膜完整性起到非常重要的作用［12］，精制胃樂膠囊各組胃黏膜中EGF表達(dá)較模型組強(qiáng)，表明精制胃樂膠囊可能通過EGF表達(dá)增加，而促進(jìn)上皮增殖、維護(hù)組織修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)，也提示EGF表達(dá)的增加可能是精制胃樂膠囊治療胃潰瘍的重要機(jī)制之一。

綜上所述，精制胃樂膠囊對(duì)乙酸型胃潰瘍具有顯著治療作用，可降低潰瘍指數(shù)，增強(qiáng)胃黏膜組織 EGF的表達(dá)，促進(jìn)胃潰瘍損傷黏膜的修復(fù)，顯示出精制胃樂膠囊在治療胃潰瘍方面，具有多靶點(diǎn)綜合作用的優(yōu)勢(shì)，值得深入研究。

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